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Cellular and molecular aspects of the anti-inflammatory effects of low-dose radiation therapy

Large, Martin :
Cellular and molecular aspects of the anti-inflammatory effects of low-dose radiation therapy.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Cellular and molecular aspects of the anti-inflammatory effects of low-dose radiation therapy
Language: English
Abstract:

For decades an anti-inflammatory and analgesic effect of low-dose X-irradiation (LD-RT) has clinically been well established in the treatment of a plethora of benign diseases and chronic degenerative disorders with empirically identified single doses < 1 Gy to be most effective. Although considerable progress has been achieved in the understanding of immune modulatory effects of ionising radiation, especially in the low-dose range, the underlying molecular mechanisms are currently not fully resolved. Nevertheless, a modulation of endothelial cell (EC) activity has already been proven to comprise a key element in the therapeutic effects of LD-RT. In line with that, a putative interrelationship between DNA damage repair and a discontinuous dose-response relationship following low-dose irradiation was recently suggested. Moreover, a mechanistic involvement of reactive oxygen species (ROS) production and the cellular antioxidative response to give rise or contribute to these phenomena in endothelial cells remain elusive. Thus, in the present study, radiation effects with a particular focus on low-dose irradiation of ECs were investigated. To analyse DNA repair capacity, phospho-histone H2AX foci were assayed at 1 h, 4 h and 24 h after irradiation. ROS production, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and transcription factor nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) expression and activity were analysed by western immunoblotting, fluorometric 2',7'-dichlorodihydrofluorescein-diacetate (H2DCFDA), colorimetric assays, flow-cytometry and real-time PCR, respectively. A functional impact of ROS on γH2AX foci numbers and on peripheral blood mononuclear cell (PBMC) adhesion to ECs was assayed in the presence of the ROS scavenger N-acetyl-L-cysteine (NAC) and the Nrf2 activator AI-1. Irrespective of inflammatory stimulation by tumour necrosis factor-α (TNF-α), immortalised EA.hy926 ECs cells revealed a linear dose-response characteristic of γH2AX foci levels at 1 h and 4 h after irradiation. By contrast, at 24 h after irradiation a discontinuity in residual γH2AX foci levels with locally elevated values following a 0.5 Gy exposure were observed. This effect was unlikely caused by modulation of DNA damage repair, as proven by small molecule inhibitors targeting either the repair pathways homologous recombination (HR) or non-homologous end joining (NHEJ). However, the discontinuity in γH2AX foci levels was abolished by treatment with N-acetyl-L-cysteine (NAC), indicating an involvement of ROS. In line with that, in EA.hy926 ECs a discontinuous expression and enzymatic activity of SOD, CAT and GPx concomitant with a lowered expression and DNA-binding activity of the redox sensitive transcription factor Nrf2 most pronounced after a dose of 0.5 Gy was observed. Finally, scavenging of ROS by NAC or activation of Nrf2 by AI-1 significantly diminished a lowered adhesion of PBMC to EC, typically detectable following irradiation with a dose of 0.5 Gy In conclusion, these results indicate a non-linear regulation of ROS production, major compounds of the antioxidative system including SOD, CAT, GPx and Nrf2 expression and activity in EA.hy926 EC following irradiation with doses < 1 Gy. This functionally contributes to a discontinuous level of residual γH2AX foci and a hampered leukocyte/EC adhesion. These data may thus contribute a further component to the plethora of mechanisms implicated in the anti-inflammatory effects of low-dose X-ray exposure.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Bereits seit Jahrzehnten ist eine niedrig dosierte Röntgenbestrahlung (LD-RT) in der Therapie einer Vielzahl von gutartigen und chronisch degenerativen Erkrankungen etabliert. Dabei wurden Einzeldosen < 1 Gy empirisch als die am wirksamsten identifiziert. Obwohl erhebliche Fortschritte in der Aufklärung der immunmodulierenden Effekte ionisierender Strahlung - insbesondere im Bereich niedriger Dosen - erzielt wurden, sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen derzeit nur unzureichend verstanden. Nichtsdestotrotz konnte bereits eine Modulation der Aktivität von Endothelzellen als entscheidendes Element der therapeutischen Effekte einer LD-RT verifiziert werden. Zusätzlich wurde kürzlich ein möglicher Zusammenhang zwischen der DNA-Schadensreparatur und einer diskontinuierlichen Dosis-Wirkungsbeziehung nach Bestrahlung mit niedrigen Dosen entdeckt. Darüber hinaus ist ein Einfluss der Produktion reaktiver Sauerstoffmetaboliten (ROS) und der zellulären anti-oxidativen Antwort als mögliche Ursache oder Beitrag zu diesen Phänomenen in Endothelzellen bisher ungeklärt. Entsprechend wurden in der vorliegenden Arbeit Bestrahlungseffekte in Endothelzellen mit Fokus auf eine Niedrigdosis-Bestrahlung untersucht. Für die Analyse der DNA-Reparaturkapazität wurden Phospho-Histon H2AX Foci eine, vier und 24 Stunden nach Bestrahlung analysiert. Die Produktion von ROS, die Expression und Aktivität der Enzyme Superoxid Dismutase (SOD), Katalase (CAT), Gluthation-Peroxidase (GPx) und des Transkriptionsfaktors Nuclear Factor E2-related Factor 2 (Nrf2) wurden mittels Western Blot, fluorometrischer 2',7'-Dichlorodi-hydrofluorescein-diacetat (H2DCFDA) Messung, kolorimetrischen Assays, Durchfluss-zytometrie und quantitativer PCR analysiert. Ein funktioneller Einfluss von ROS auf das Level der γH2AX Foci und die Adhäsion mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) an EC wurde durch den Einsatz des ROS-Fängers N-Acetyl-L-Cysteins (NAC) und des Nrf2-Aktivators AI-1 untersucht. Dabei wies die immortalisierte Endothelzelllinie EA.hy926, unabhängig von einer pro-inflammatorischen Aktivierung durch Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), einen lineare Dosis-Wirkungs-Beziehung an γH2AX Foci eine und vier Stunden nach Bestrahlung auf. Im Gegensatz dazu konnte 24 Stunden nach einer Bestrahlung, ein diskontinuierliches Level an γH2AX Foci mit erhöhten Werten nach einer Bestrahlung mit 0,5 Gy beobachtet werden. Dieser Effekt wird vermutlich nicht durch eine Modulation der DNA-Schadens-Reparatur hervorgerufen, wie Versuche mit niedermolekularen Inhibitoren für die Reparaturmechanismem homologe Rekombination (HR) und nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) nahelegen. Im Gegensatz dazu konnte die Diskontinuität in der Ausprägung der γH2AX Foci nach Behandlung mit dem ROS-Fänger NAC aufgehoben werden, welches auf eine Beteiligung von ROS an diesem Phänomen hindeutet. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen gelang es, in EA.hy926 Zellen eine nicht-lineare Expression und enzymatische Aktivität von SOD, CAT und GPx zusammen mit einer verringerten Expression und DNA-Bindungsaktivität des redox-sensitiven Transkriptionsfaktors Nrf2 mit der höchsten Ausprägung nach einer Bestrahlung mit 0,5 Gy nachzuweisen. Schließlich führte eine NAC-vermittelte Hemmung von ROS oder die Aktivierung von Nrf2 durch AI-1 zu einer signifikanten Aufhebung der typischerweise nach Bestrahlung mit einer Dosis von 0,5 Gy beobachteten PBMC/EC-Adhäsions-minderung. Zusammenfassend belegen die Ergebnisse eine nicht-lineare Regulation der ROS-Produktion und der Expression und Aktivität von Schlüsselelementen des anti-oxidativen Systems (SOD, CAT, GPx und Nrf2) in EA.hy926 EC nach Bestrahlungen im Dosisbereich < 1 Gy. Auf funktionaler Ebene tragen die erwähnten Effekte zu einem diskontinuierlichen Level von γH2AX Foci und einer verminderten Leukozytenadhäsion bei. Diese Daten tragen somit weitere Komponenten in der Vielzahl der Mechanismen bei, die an den anti-inflammatorischen Effekten einer niedrig dosierten Röntgenbestrahlung beteiligt sind.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 28 Sep 2015 11:49
Last Modified: 20 Jul 2016 12:56
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-49772
Referees: Rödel, Prof. Franz and Löbrich, Prof. Markus and Laube, Prof. Bodo
Refereed: 21 September 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4977
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