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Characterization of genetic alterations in the cardiac HCN4 channel

Biel, Stephanie :
Characterization of genetic alterations in the cardiac HCN4 channel.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Characterization of genetic alterations in the cardiac HCN4 channel
Language: English
Abstract:

Brugada (BrS) and Sick Sinus Syndrome (SSS) are inheritable diseases, which are characterized by different cardiac arrhythmias. Tachy- and bradycardy as well as sinoatrial block, sinus rest or cardiac arrest are clinical manifestations of these diseases, which may be detected in electro¬cardio¬grams of affected persons. Both BrS and SSS are not based only on clinical, but also on symptomatic features. Symptoms like chronotropic incompetence, dizziness, syncopes, palpitations or atrial/ ventriculare fibrillation until sudden cardiac arrest are results of such cardiac arrhythmias. The appearance and occurrence of these symptoms are phenotypic and not always existing, which makes the diagnosis of these diseases based only on clinical and symptomatic criteria very difficult. Over the last years, a number of genetic abnormalities in genes encoding subunits of cardiac potassium, sodium and calcium channels, as well as in genes involved in the trafficking or regulation of these channels could be associated with both syndromes. Therefore, genetic screening of persons at a potential risk should be performed for diagnosing.

HCN4 is one of these genes, which could be associated with BrS and SSS. It encodes the hyperpolarization-activated, cyclic nucleotide-gated cation channel, which is crucial for the uninterrupted function of the sinoatrial node in the heart. HCN4 is one of four isoforms (HCN1-4) and is mainly expressed in the brain and the heart to generate a pacemaker impulse for autonomic activity. These channels are voltage-gated and are activated by the membrane hyperpolarization. In a ratio of 1:3 to 1:5, Na+ and K+ ions flow through a pore, which is formed by four subunits of the channel. As a consequence of the activity of the HCN4 channel the membrane depolarizes to the threshold voltage, which in turn triggers the subsequent action potential. Mutations in the HCN4 gene may lead to cardiac dysfunctions, which occur in diseases such as BrS and SSS. To date, more than 23 mutations in the HCN4 gene have been identified and associated with clinically established or potential sinus node dysfunctions.

In the present study, genetic screening of patients with suspected or diagnosed Brugada or Sick Sinus Syndrome was performed to identify new mutations in the HCN4 gene. In the coding HCN4 region of 62 patients, six already known and one novel sequence alteration were detected: two are located in exon 1 (N-terminus), two in exon 4 (one in the pore and one in the beginning of the C-terminus loop) and three in exon 8 (C-terminus loop). All of these six base exchanges are listed in the NCBI-database (National Center of Bio¬technology) as sequence variations with no functional modification. The new sequence variant V492F was not listed in the database and is located in the highly conserved pore region of the HCN4 channel. To prove, whether this variant is a common polymorphism or a novel mutation, 100 blood samples of healthy persons were tested. None of these samples contained this new sequence variation, what suggests a new mutation. The subsequent electrophysiological investigations on HEK293 cells expressing the HCN4-V492F mutant and three additional variants (V492A/-D/-R) at the protein position V492 indicated a reduced channel conductance in comparison to HEK293 cells expressing the HCN4-WT. This may not be exclusively attributed to a functional disorder of the channel, but may also be due to an impairment of the protein synthesis or of trafficking the channel protein to the cell surface. To address this question, the distribution of GFP tagged HCN4-WT and of mutant channels were investigated in HEK293 cells using confocal laser scanning microscopy (CLSM). The CLSM images of HEK293 cells expressing the respective mutated channels showed the same intracellular distribution and local concentration of the HCN4 protein as the images of HEK293 cells expressing the HCN4-WT. The modified technique nabopac was additionally used to isolate plasma membrane patches from cells, which had been transfected with DNA of HCN4-WT or of the several mutated channels. These highly pure plasma membrane patches showed no differences in their GFP fluorescence intensity, which indicates that an amino acid exchange in position 492 of the HCN4 protein apparently neither impaired the synthesis nor the trafficking of the channel.

Taken together, the reduced conductance of a HCN4-V492F mutant is apparently caused only by an aberrant function of the channel protein. The reduced channel conductance explains the symptoms the mutation carrier exhibits, who is suffering from unclear syncopes in resting situations and confirms the BrS diagnosis.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Das Brugada (BrS) und das Sick Sinus Syndrom (SSS) sind vererbbare Erkrankungen, welche sich durch verschiedene kardiale Arrhythmien auszeichnen. Tachykardien und Bradykardien sowie ein sinoatrialer Block, Sinuspausen oder Herzstillstand sind klinische Manifestationen dieser Krankheiten, welche sich im Elektrokardiogramm von betroffenen Personen zeigen können. Sowohl BrS als auch SSS basieren nicht nur auf klinischen, sondern auch auf symptomatischen Eigenschaften. Symptome wie die chronotrope Inkompetenz, Schwäche, Synkopen, Herzklopfen oder atriales/ventrikuläres Flimmern bis hin zum plötzlichen Herzstillstand sind das Ergebnis solcher kardialen Arrhythmien. Das Auftreten und die Ausprägungen dieser Symptome sind phänotypisch und nicht immer existent, was die Diagnose dieser Erkrankungen nur anhand der klinischen und symptomatischen Kriterien sehr schwierig macht. In den vergangenen Jahren konnten immer mehr genetische Anomalien in Genen, welche die Unter-einheiten von Kalium-, Natrium- und Calciumkanälen kodieren, sowie in Genen, die in den Transport oder die Regulation dieser Kanäle involviert sind, mit beiden Krankheiten assoziiert werden. Ein genetisches Screening sollte daher in die Untersuchung von eventuell gefährdeten Personen mit einbezogen werden. HCN4 ist eines der Gene, welches mit BrS und SSS assoziiert werden konnte. Es kodiert einen hyper-polarisations-aktivierten und zyklisch nukleotid-gesteuerten Kationenkanal, welcher für die reibungs-lose Funktion des Sinusknoten im Herzen wichtig ist. HCN4 ist einer von vier Isoformen (HCN1-4) und wird hauptsächlich im Gehirn und im Herzen exprimiert, um dort die autonome Aktivität eines Schrittmacherimpulses zu generieren. Diese Kanäle sind spannungs¬ab¬hängig und werden durch die Membranhyperpolarisierung aktiviert. Natrium- und Kaliumionen strömen in einem Verhältnis 1:3 oder 1:5 durch eine Pore ein, welche durch vier Untereinheiten des Kanals geformt wird. Dadurch depolarisiert die Spannung zur der Schwelle, bei der das nächste Aktionspotentail ausgelöst wird. Mutationen im HCN4 Gen können zu kardialen Dysfunktionen führen, welche häufig mit Krankheiten wie dem BrS oder SSS assoziiert sind. Bis heute wurden mehr als 23 Mutationen im HCN4 Gen identifiziert und mit klinisch etablierten oder potentiellen Dysfunktionen des Sinusknotens in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit wurde ein genetisches Screening von Patienten mit der Diagnose oder dem Verdacht auf Brugada oder Sick Sinus Syndrom durchgeführt, um neue Mutationen im HCN4 Gen zu identifizieren. In der kodierenden HCN4 Region von 62 Patienten wurden sechs bereits bekannte und eine neue Sequenzabweichung detektiert: zwei befinden sich in Exon 1 (N-Terminus), zwei in Exon 4 (eine in der Pore und eine am Anfang der Schleife des C-Teminus) und drei in Exon 8 (C-Terminus). Jeder der sechs bekannten Basenaustausche ist in der NCBI Datenbank (National Center of Biotechnologie) als eine Sequenzvariante ohne funktionelle Folge gelistet. Die neue Sequenz¬variante V492F war nicht in der Datenbank aufgeführt und befindet sich in der hoch konservierten Porenregion des HCN4 Kanals. Um zu prüfen, ob es sich um einen häufigen Polymorphismus oder eine neue Mutation handelt, wurden 100 Blutproben gesunder Personen untersucht. Keine dieser Proben enthielt diese neue Sequenzvariante, was auf eine Mutation schließen lässt. Die im Anschluss durchgeführten elektrophysiologischen Untersuchungen an HEK293 Zellen, welche die HCN4-V492F Mutante und drei weitere Varianten (V492A/-D/-R) an der Proteinposition V492 exprimierten, zeigten eine reduzierte Kanalleitfähigkeit im Vergleich zu den HEK293 Zellen, welche den HCN4-WT exprimierten. Dies lässt sich nicht ausschließlich auf eine funktionelle Störung des Kanals zurückführen, sondern könnte auch Folge einer Beeinträchtigung der Proteinsynthese oder des Transportes der Proteine zur Zellmembran sein. Hierzu wurden GFP markierte HCN4-WT und mutierte Kanäle in HEK293 Zellen mittels konfokaler Laser-Mikroskopie (CLSM) untersucht. Die CLSM-Aufnahmen zeigten alle die gleiche zelluläre Verteilung und lokale Konzentration der mutierten als auch nicht mutierten HCN4 Proteine. Mittels der modifizierten Technik Napobac, wurden zusätzlich Plasmamembran-Fragmente der Zellen isoliert, welche mit der DNA des HCN4-WT oder der verschiedenen mutierten Kanäle transfiziert wurden. Diese hoch reinen Membranflecken wiesen keine nennenswerte Unterschiede in ihrer GFP Fluoreszenz¬intensität auf, was darauf hindeutet, dass ein Aminosäureaustausch in der Position 492 des HCN4 Proteins offenbar weder die Proteinsynthese noch den Transport des Kanalproteins zur Zellmembran beeinträchtigt. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die reduzierte Leitfähigkeit der HCN4-V492F Mutante offenbar nur durch eine funktionelle Störung des Kanals verursacht wird. Die reduzierte Leitfähigkeit des HCN4 Kanals erklärt die Symptome des Mutationsträgers, welcher an unklaren Synkopen in stressfreien Situationen leidet und bestätigt den Verdacht auf Brugada Syndrom.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 05 Oct 2015 11:16
Last Modified: 16 Oct 2015 07:02
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-49643
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Laube, Prof. Dr. Bodo and Kauferstein, PD Dr. Silke
Refereed: 16 July 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4964
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