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Differentielle Genexpression in dem hyperthermophilen Archaeon Sulfolobus solfataricus nach Hitzeschock

Martusewitsch, Erika :
Differentielle Genexpression in dem hyperthermophilen Archaeon Sulfolobus solfataricus nach Hitzeschock.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2004)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Differentielle Genexpression in dem hyperthermophilen Archaeon Sulfolobus solfataricus nach Hitzeschock
Language: German
Abstract:

In den Grundzügen ihrer zentralen zellulären Prozesse ähneln Archaea häufig den Eukaryoten und sie weisen viele homologe Proteine mit diesen auf. Diese Beobachtungen bleiben allerdings häufig auf vergleichende Genomanalysen und -vorhersagen beschränkt, da sich viele Archaea aufgrund ihrer extremen Wachstumsanforderungen nur schwer analysieren lassen. Bis heute ist daher vergleichsweise wenig über globale Genregulation z.B. nach Stressreaktionen in Archaea bekannt und darüber, welche Proteine mit dem "eukaryotischen" basalen Transkriptionsapparat interagieren. Besonders bei hyperthermophilen Archaea ist es von Interesse aufzuklären, wie die Zellen auf plötzliche Temperaturveränderungen, z.B. Hitzeschock, reagieren. Um die Hitzeschockreaktion an dem hyperthermophilen Modellorganismus Sulfolobus solfataricus studieren zu können, wurden zunächst die Bedingungen, welche Thermoadaption bzw. Hitzeschock auslösen, bestimmt. Es zeigte sich, dass der Organismus eine Thermotoleranz gegenüber letalen Temperaturen von 96°C entwickelte, wenn er vorher bei moderaten Hitzeschocktemperaturen von 88°C adaptiert wurde. In Northern-Analysen wurde 30 Minuten nach Hitzeschock bei 88°C eine verstärkte Transkription des Gens für die alpha Untereinheit des Thermosoms (TF55) festgestellt, dem Chaperonin und Hsp60-Homolog der Archaea. Für die Identifizierung von differentiell exprimierten Genen nach Hitzeschock wurde die differential display Methode (DD-PCR) für S. solfataricus etabliert und angewendet. Hierfür wurde die aus Zellen vor und nach Hitzeschock isolierte RNA in cDNA revers transkribiert und anschliessend mit Zufallsprimern amplifiziert. Dadurch wurde ein Gemisch von Amplifikaten erhalten, die ein komplexes und reproduzierbares Transkriptionsmuster vor und nach Hitzeschock lieferten. Unter Verwendung verschiedener Kombinationen von Oligonukleotiden in der DD-PCR wurden insgesamt 32 cDNA-Fragmente erhalten, deren Mengen nach Hitzeschock zunahmen. Durch Sequenzanalyse konnten diese 18 verschiedenen, potentiellen Hitzeschockgenen im S. solfataricus Genom zugeordnet werden. Darunter befand sich auch tf55alpha. In einer quantitativen PCR mit genspezifischen Primern wurden relative Zunahmen der mRNA-Mengen nach Hitzeschock bestimmt. Bei 13 der in der DD-PCR identifizierten Gene konnte eine Induktion verifiziert werden. Darunter war tf55alpha mit 10,4-fach am stärksten induziert, die übrigen, neu identifizierten Hitzeschockgene wiesen moderate Induktionen von 1,5- bis 3,1-fach auf. Zusätzlich wurden auch Homologe bekannter Hitzeschockgene und basaler Transkriptionsfaktoren in die quantitativen Analysen einbezogen. Dazu gehörten die Gene der beta und gamma Untereinheit des Thermosoms, der Chaperone Prefoldin, Hsp20-1 und 2, der Proteasen HtrA und Htpx, sowie der Transkriptionsfaktoren TBP, TFB-1 und 2. Die meisten dieser Gene waren nach Hitzeschock zwischen 1,8-fach (Prefoldin) und 5,4-fach (htrA) induziert, die Transkriptmengen von tf55gamma, tbp und tfb-2 nahmen jedoch nach Hitzeschock ab. Insgesamt wurde somit bezüglich der relativen Transkriptmengen eine moderate Hitzeschockantwort in S. solfataricus festgestellt. Sieben der neu identifizierten Hitzeschockgene konnte aufgrund von Ähnlichkeiten mit Genen aus den öffentlichen Datenbanken eine Funktion zugeordnet werden. Neben tf55alpha wurden so Gene für eine potentielle Transposase und von an diversen physiologischen Reaktionen beteiligten Proteinen identifiziert. Die übrigen Hitzeschockgene hatten bisher unbekannte Funktionen und ihr Vorkommen war allein auf die Archaea oder die Gattung Sulfolobus beschränkt. Darunter waren drei Gene, deren Proteinsequenzen in S. solfataricus zu einer sieben Mitglieder umfassenden Familie mit coiled-coil Strukuren gehörten, welche im konservierten C-Terminus ein Motiv von RecBC-Endonukleasen enthielten. Ein anderes potentielles Hitzeschockgen zeigte entfernte Ähnlichkeiten mit HrcA, einem transkriptionellen Repressor von Hitzeschockgenen in Bakterien. Um einen Einblick in die Regulation der Hitzeschockgene zu bekommen, wurden die Transkriptionsstartstellen von fünf neu identifizierten Hitzeschockproteinen sowie von tf55alpha und tf55beta bestimmt. In einer Entfernung von 21 bis 26 Nukleotide stromauf vom Transkriptionsstart wurden die basalen Promotorelemente TATA-Box und BRE-Element identifiziert, welche dem bekannten, archaealen Konsensus entsprachen. Ausserdem wurden zwei AT-reiche Strukturen zwischen den Promotoren und Transkriptionsstarts der Hitzeschockgene gefunden, die potentielle cis-regulatorische Elemente darstellen könnten. Mit dieser Arbeit konnten erste Einblicke in die Hitzeschockantwort eines hyperthermophilen Archaeons erhalten werden. Durch die Identifizierung potentieller cis-regulatorischer Elemente, eines mit dem HrcA-Repressor verwandten Proteingens sowie einer neuen, RecBC-ähnlichen Endonukleasenfamilie sind Grundlagen für die Erforschung der Hitzeschockantwort in S. solfataricus gelegt worden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The basic cellular processes of archaea show many similarities with the ones of eukaryotes. Up to now these findings are mainly based on comparative genome analyses and predictions, as many archaea are difficult to analyse due to their extreme growing conditions. That’s why only little is known about gene regulation such as stress mechanisms in archaea, as well as about the proteins, which interact with the eukaryal-like basic transcriptional apparatus. Especially hyperthermophilc archaea are interesting objects for studies, how the cells react to temperature changes like heat shock. In order to study the heat shock reaction in the hyperthermophilic model organism Sulfolobus solfataricus first the conditions were determined, which cause thermoadaptation and heat shock. It turned out that this organism exhibited an acquired thermotolerance at lethal temperatures of 96°C, when the cells were adapted at a moderate heat shock of 88°C. Northern analyses revealed an increased transcription of the gene coding for the alpha subunit of the thermosome (TF55), which is the chaperonin and Hsp-60 homolog in archaea. For the identification of differentially expressed genes after heat shock a method called differential display (DD-PCR) was established for S. solfataricus and was applied. Therefore RNA isolated from cells with and without heat shock was reverse transcribed following amplification with random primers. A mixture of PCR-products was obtained, which yielded complex and reproducible transcriptional patterns before and after heat shock. By using various combinations of oligonukleotides for DD-PCR a total of 32 cDNA-fragments with increasing amounts after heat shock were obtained. After sequence analysis they could be assigned to 18 different potential heat shock genes in the S. solfataricus genome sequence. Among them tf55alpha was identified as well. In a quantitative PCR method with gene specific primers the relative increase of mRNA amounts after heat shock was determined. An induction could be verified for 13 genes identified by DD-PCR. Highest expression levels of up to 10.4-fold were observed for tf55alpha whereas all other genes were only moderately induced in a range of 1.5- to 3.1-fold. Furthermore homologs of known heat shock genes and of basic transcription factors were included in this quantitative analysis. Among them were the thermosome subunits beta and gamma, the chaperones prefoldin, Hsp20-1 and 2, the proteases HtrA and HtpX, as well as the transcription factors TBP, TFB-1 and 2. Most of the genes exhibited induction levels from 1.8-fold (prefoldin) to 5.4-fold (htrA) after heat shock, whereas the mRNA amounts of tf55gamma, tpb and tfb-2 decreased. In summary a moderate heat shock response was observed in S. solfataricus. Seven of the 13 newly identified heat shock genes could be assigned a function. Besides tf55alpha further genes were identified, which coded for a potential transposase and several proteins involved in various physiological processes. The remaining heat shock genes had no known functions so far and their occurrence was restricted to archaea or Sulfolobus. Three of these genes belonged to a protein family with coiled-coil structures found in the S. solfataricus genome comprising a total of seven members and their conserved C-termini showed similarities to the family of RecBC-like endonucleases. Another potential heat shock gene displayed distant relationship to hrcA-like transcriptional repressor proteins of heat shock genes in bacteria. In order to get an insight into the gene regulation, the transcription start sites of 5 newly identified heat shock genes and of tf55alpha and tf55beta were determined. In a distance of 21 to 26 nucleotides upstream of the transcription start site the basic promoter elements TATA-box and BRE-element were identified, which matched the consensus of standard archaeal promoters. Furthermore two AT-rich structures were identified between promoter and transcription start site, which could constitute potential cis-regulatory elements. This work gives first insights into the heat shock response of a hyperthermophilic archaeon. By identifying potential cis-regulatory elements, an HrcA-repressor related gene, as well as a new RecBC-like endonuclease family, first basics for investigations of heat shock reactions in S. solfataricus were set.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:21
Last Modified: 07 Dec 2012 11:50
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000484
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-4847
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Schleper, PD Dr. Christa and Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Advisors: Schleper, PD Dr. Christa
Refereed: 16 July 2004
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/484
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