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Binding partners for mouse acetylcholinesterase in the central nervous system

Paraoanu, Laura Elena :
Binding partners for mouse acetylcholinesterase in the central nervous system.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2004)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Binding partners for mouse acetylcholinesterase in the central nervous system
Language: English
Abstract:

Acetylcholinesterase (AChE) is the enzyme that hydrolyses the neurotransmitter acetylcholine at the cholinergic synapses. Besides this principal role, called the classical function, AChE shows also other non-classical functions related to processes during embryonic development and diseases. The existence of multiple molecular forms, the homology with other neuronal cell adhesion molecules, and the early expression pattern, suggest that AChE may function in cell adhesion, and thus in neurite growth, guidance and even synaptogenesis. To gain an insight into the noncholinergic, cell adhesion promoting functions of acetylcholinesterase, we sought proteins interacting with it. Since AChE is mostly an extracellular or membrane- attached molecule, the binding partners for AChE should be: expressed in the same tissues and at the same developmental stages as AChE, have both an extracellular and an intracellular domain connected through one or more transmembrane domains, and possibly be able to initiate an intracellular signaling cascade. Due to the 34% sequence identity between AChE and neuroligin-1, a neuronal cell adhesion molecule, we postulated that the neuroligin’s binding partner, neurexin, may bind to AChE. Initially, we had to show that the AChE binding partner is expressed in the same tissues and at the same time with AChE. The pattern of expression of neurexin-1â and AChE was analyzed in the chicken retina using in situ hybridization. The results show that AChE-positive cells in the retina also coexpress neurexin, with AChE preceding neurexin (~48h). Both are strongly expressed long before synaptogenesis, which starts about embryonic day 13 in the chicken retina. Their expression profiles are consistent with the hypothesis that the neurexins and AChE have a function in early neuronal differentiation and axonogenesis. However, no specific neurexin-1â binding to AChE was evident using surface plasmon resonance (Comoletti et al., 2003). In the second part of the work, a yeast two-hybrid screen was initiated aimed at identifying novel proteins that interact directly with AChE. 2X106 clones from a cDNA mouse brain library were screened with a bait containing exons 2, 3 and 4 from ACHE mouse gene. 190 His positive clones were identified and from these clones 96 were also positive on â- galactosidase test. The plasmids were isolated, re- transformed in E.coli, and controlled for the presence and size of the cDNA insert. From 96 clones, we thereby identified 23 prey clones that 1) grew well on histidine-free plates and displayed strong b-galactosidase activity, when coexpressed with the bait, and 2) showed no interaction with the reporter genes in coexpression with LexA binding domain or with control fusions lamin-LexA binding domain and p53-LexA binding domain. This strongly suggested that the proteins encoded by these clones are binding partners of acetylcholinesterase in yeast. Summary 106Sequencing of the cDNA inserts of the clones identified 18 independent candidates: 7 are unknown proteins and 11 are already known mouse proteins. From the 11 known mouse proteins, 4 were membrane and extracellular proteins, 2 were transcription activators, 2 were synaptic proteins and 3 were kinases. Due to its subcellular localization, structure and functions, we first focused on showing that laminin is binding to AChE in another system than yeast. Confirming the interaction between AChE and its binding partners outside yeast is the first step after a screen. By a yeast two-hybrid approach, we identified an interaction between the AChE and an 898 bp fragment of laminin-beta1 chain, an extracellular matrix protein involved in neuronal differentiation and adhesion processes. The yeast two-hybrid data indicated that the interaction between these two proteins is moderately strong and that the region containing 240th amino acid residue to 503th amino acid residues of AChE is essential for interaction. The interaction was confirmed by co-immunoprecipitation assays. In addition, the co-immunoprecipitation showed that the binding was highly dependent on the NaCl concentration used in the interaction buffer. These results confirm the observations of Johnson (Johnson and Moore, 2003), indicating that an electrostatic mechanism may be involved in binding. This led to the model in which AChE is binding to laminin-1 during early developmental stages. Laminin-1 interacts with integrin receptors (Teller and Beaulieu, 2001) and is so able to send signals into the cell modulating signaling cascades. Taken together, the results of this present study suggest a role for AChE in heterophilic adhesion. Understanding this role will bring a major progress in the field of non-classical functions of AChE.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die Acetylcholinesterase (AChE) wurde als Enzym beschrieben, das an der Termination der Signalübertragung an der neuromuskulären Endplatte beteiligt ist. Sowohl dort als auch im zentralen und peripheren Nervensystem (ZNS und PNS) spaltet die AChE den Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) in die Produkte Acetat und Cholin. Neben dieser so genannten klassischen Funktion zeigt AChE auch andere, nicht-klassische Funktionen, die bei Prozessen während der embryonalen Entwicklung und bei bestimmten Krankheiten eine Rolle spielen. Das Vorliegen mehrerer molekularer Formen, die Homologie mit anderen neuronalen Zell-Adhäsions-Molekülen und das frühe Expressionsmuster deuten darauf hin, dass die AChE an der Zelladhäsion beteiligt sein könnte und auch beim Neuritenwachstum, bei der Wegfindung der Neuriten und bei der Synaptogenese eine Rolle spielt. Um einen Einblick in die nicht-cholinerge Rolle der AChE bei der Zell-Adhäsion zu gewinnen, habe ich nach Interaktionspartnern der AChE gesucht. Da die AChE meistens extrazellulär oder in der Membran-verankert vorliegt, sollten die AChE- Bindungspartner: (i) in den gleichen Geweben und während den gleichen Entwicklungsstadien wie AChE exprimiert sein, (ii) eine extra- und intrazelluläre Domäne besitzen, die durch eine oder mehrere Transmembranregionen verbunden sind, und (iii) möglicherweise in der Lage sein, eine intrazelluläre Signalkaskade einzuleiten. Aufgrund der 34%igen Sequenzhomologie zwischen AChE und Neuroligin-1 (neuronales Zell-Adhäsion Molekül), postulieren wir, dass Neurexin-1â, der Interaktionspartner von Neuroligin-1, an die AChE binden kann. Zuerst mussten wir zeigen, daß der AChE-Bindungspartner in den gleichen Geweben und zur selben Zeit wie AChE exprimiert wird. Die Expressionsmuster von neurexin-1â und AChE wurden in der Hühnerretina mit Hilfe der in situ Hybridisierung analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass AChE-positive Zellen in der Retina neurexin-1â co-exprimieren, wobei AChE etwa 48h vor neurexin exprimiert wird. Beide Gene werden lange vor der Synaptogenese, welche in der Hühnerretina am Embryonaltag 13 beginnt, stark exprimiert. Damit sind die ersten wichtigen Voraussetzungen für einen funktionellen Zusammenhang zwischen den beiden Proteinen gegeben und die Hypothese, dass die Neurexine und AChE an der frühen neuronalen Differenzierung und Axogenese beteiligt sind, wird unterstützt. Jedoch konnte keine spezifische Bindung zwischen neurexin-1â und AChE durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz festgestellt werden (Comoletti et al., 2003). Im zweiten Teil der Arbeit wurde mit einem Hefe-Hybrid- („Yeast-Two-Hybrid“-) System nach möglichen AChE- Interaktionspartnern gesucht. 2 x 106 Klone einer cDNA- Bibliothek aus einem Mausgehirn wurden mit einem „Köder“, welcher die Exons 2, 3 und 4 des AChE-Mausgen enthielt, gescreent, d.h. auf Bindungspartner hin untersucht. 190 His- positive Klone wurden isoliert und von diesen erwiesen sich nach einem â-Galaktosidase Test wiederum 96 Klone als zusätzlich LacZ-positiv. Die Plasmide wurden isoliert, in E.coli re- transformiert und auf die Gegenwart und Größe des cDNA-Inserts hin getestet (mittels Sequenzierung). Von 96 Klonen konnten 23 als „echte“ Interaktionspartner identifiziert werden, da sie 1) gut auf Histidin-freien Platten wuchsen und starke â-Galaktosidase-Aktivität zeigten, wenn sie mit dem „Köder“ co-exprimiert wurden, und 2) keine Aktivierung des Reportergens zeigten, wenn sie mit der LexA-Bindungsdomäne oder den Kontroll-Fusionen lamin-LexA-Bindungsdomäne und p53-LexA-Bindungsdomäne co-exprimiert wurden.. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass die Proteine, die durch diese cDNA Klonen kodiert werden, AChE-Bindungspartner in Hefe sind. Durch Sequenzierung der „Beute“-DNA dieser Klone konnten 18 unabhängige Interaktionspartnern identifiziert werden: bei sieben davon handelte es sich um bisher unbekannte Proteine und 11 davon sind bereits bekannte Mausproteine. Von den 11 bekannten Mausproteinen waren vier Membran- und extrazelluläre Proteine, zwei waren Transkriptionsaktivatoren, zwei waren synaptische Proteine und bei dreien handelte es sich um Kinasen (. Aufgrund ihrer subzellulären Lokalisierung, ihrer Struktur und Funktionen, wollte ich zuerst zeigen, daß Laminin und Tetraspanin an AChE - auch in einem anderen System als Hefe - binden. Die Bestätigung der Interaktion zwischen AChE und seiner Bindungspartner außerhalb der Hefe ist der erste Schritt nach einem Screen. Mithilfe eines Hefe-Hybrid-Systems („Yeast-Two-Hybrid“), wurde eine Interaktion zwischen AChE und einem 898 bp Fragment der Laminin-beta1-Kette nachgewiesen. Laminin-1 ist ein extrazelluläres Matrixprotein, das eine Rolle bei der neuronalen Differenzierung und bei Adhäsionsprozessen spielt. Die „Yeast Two-Hybrid“-Daten zeigten, dass die Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen relativ stark ist und dass die Region zwischen dem 240ten und 503ten Aminosäurerest der AChE für Interaktionen essentiell ist. Die Interaktion wurde durch Co-Immunopräzipitation bestätigt. Zusätzlich zeigten die Co-Immunopräzipitations-Experimente, dass die Interaktion stark von der NaCl-Konzentration im Interaktionspuffer abhängig ist. Diese Resultate bestätigen die Beobachtungen von Johnson (Johnson und Moore, 2003) und zeigen dass ein elektrostatischer Bindemechanismus vorliegen könnte. Diese Ergebnisse führten zu dem Modell, in dem AChE während der frühen Entwicklungsstadien an Laminin-1 bindet. Laminin-1 interagiert mit den Integrin-Rezeptoren (Teller und Beaulieu, 2001) und ist somit in der Lage, Signale in die Zelle zu senden, um die Signal- Kaskaden zu modulieren. Zusammenfassend läßt sich aufgrund der Resultate dieser vorliegenden Arbeit eine Rolle für AChE in der heterophilen Adhäsion feststellen. Wenn diese Funktion verstanden ist, wird es einen großen Fortschritt auf dem Gebiet der nicht-klassischen Funktionen des AChE geben.German
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:21
Last Modified: 07 Dec 2012 11:50
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000478
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-4788
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Himstedt, Prof. Dr. Werner and Thiel, Prof. Dr. Gerhardt and Lindner, Prof. Dr. Hans J.
Advisors: Layer, Prof. Dr. Paul G. and Goeringer, Prof. Dr. Ulrich
Refereed: 2 July 2004
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/478
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