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Evaluation des Sphingolipid- und IL-33/ST2-Signalwegs als Quelle für diagnostische Biomarker für die limitierte Form der systemischen Sklerose

Wagner, Annika :
Evaluation des Sphingolipid- und IL-33/ST2-Signalwegs als Quelle für diagnostische Biomarker für die limitierte Form der systemischen Sklerose.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Evaluation des Sphingolipid- und IL-33/ST2-Signalwegs als Quelle für diagnostische Biomarker für die limitierte Form der systemischen Sklerose
Language: German
Abstract:

Die Pathophysiologie der systemischen Sklerose (Sklerodermie, SSc) ist bisher unvollständig erforscht. Die Sklerodermie ist eine immun-mediierte Systemerkrankung, gekennzeichnet durch eine Fibrose des Bindegewebes. Die unklare Pathophysiologie erschwert eine frühzeitige Diagnose und therapeutische Intervention bei den Patienten. Es wird angenommen, dass die vaskulären Endothelzellen, insbesondere die der mikrovaskulären Gefäße, eine wichtige Rolle zu Beginn der Erkrankung einnehmen. Erste sichtbare Anzeichen einer gestörten Mikrovaskulatur sind in über 90 % der SSc-Patienten bereits vor einer gesicherten Diagnose mittels Kapillarmikroskopie nachweisbar (1, 2). Inwiefern die Moleküle des Sphingolipid-Signalwegs und der IL-33/ST2-Achse sich für die Sklerodermie als serologische Biomarker eignen, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht. Dabei lag das Augenmerk auf der Evaluation eines Biomarkers(-Panels) zur Diagnose der Sklerodermie oder der Verlaufskontrolle bei Medikation der Sklerodermie-Patienten. Zum einen wurden Serumproben von 69 Patienten mit limitierter systemischer Sklerose (lcSSc), zwanzig Patienten mit diffuser SSc sowie zehn Patienten im frühen Stadium der SSc (LeRoy) aus Schweden und Deutschland untersucht. Als Kontrollgruppen fungierten gesunde, dem Alter und Geschlecht der SSc-Patienten angepasste, Individuen (n = 38) sowie elf Patienten mit dem idiopathischen, primärem Raynaud-Phänomen. Bei den deutschen Individuen wurde eine Kapillar-mikroskopie durchgeführt. Es wurden Plasmaproben von 175 schwedischen lcSSc-Patienten und entsprechenden 112 gesunden Probanden analysiert. Die Sphingolipid- und Glucosyl-Ceramide-Profile wurden mittels LC-MS/MS erhoben, während die Konzentrationen weiterer Proteinparameter, IL-33, sST2, DKK-1 und den Dermatofibrosemarkern COMP sowie Lysyl-Oxidase, mit spezifischen ELISA untersucht wurden. Ebenso wurde der modifizierte Rodnan-Skin-Score (mRSS) erhoben. Die statistische Analyse erfolgte mit dem Mann-Whitney-U-Test, Kruskal-Wallis-Test oder dem Spearmans Korrelationskoeffizient. Die deutschen und schwedischen lcSSc-Patienten (n = 77) zeigten einen lcSSc-typischen Auto-Antikörpertiter. Bei den deutschen lcSSc-Patienten konnten keine Auffälligkeiten in der klinischen Chemie und Hämatologie gefunden werden. Bei diesen 26 Patienten konnte bei der kapillarmikroskopischen Untersuchung die, für die SSc-charakteristische Verringerung der Kapillardichte und die Megakapillaren im Vergleich zu elf 1.RP-Patienten und drei gesunde Probanden nachgewiesen werden. Die schwedischen lcSSc-Patienten (n = 44) wiesen im frühen Stadium der lcSSc vermehrt einen frühen oder aktiven und bei fortgeschrittener Krankheit den späteren Kapillarstatus auf. Im Serum der lcSSc-Patienten war IL-33 nicht erhöht. Der sST2-Serumspiegel war bei lcSSc-Patienten mit einer Krankheitsdauer von mehr als neun Jahren (n = 29) im Vergleich zu dcSSc-Patienten (n = 20) oder früheren Stadien der lcSSc (Krankheitsdauer ein bis drei Jahren, n = 15) deutlich höher. Der sST2-Spiegel korrelierte in SSc-Patienten (n = 95) positiv mit der Krankheitsdauer. In einem auf Zytokine spezialisiertem Assay konnte gezeigt werden, dass auch PDGF-AB/BB, IL-4, EMMPRIN, IL-1ra und ENA-78 in vier lcSSc-Patienten verglichen mit vier alters- und geschlechtsübereinstimmenden Kontrollindividuen erhöht waren. Im Serum zeigte sich ein länderspezifischer Unterschied zwischen deutschen und schwedischen Individuen. In der deutschen Kontrollgruppe (n = 10) waren die S1P-Spiegel signifikant niedriger als in der schwedischen (n = 10). Die gemessenen Ceramid-Konzentrationen unterschieden sich hingegen nicht. Die Sphingosin-Serumkonzentrationen waren, normiert auf die Mittelwerte der jeweiligen gesunden Probanden, bei lcSSc-Patienten (Krankheitsdauer ein bis drei Jahren, n = 15; Krankheitsdauer vier bis neun Jahren, n = 14) im späteren Krankheitsstadium im Vergleich zu den 1.RP-Patienten erhöht. Der S1P-Spiegel der SSc-Patienten (n = 95) korrelierte mit der Erkrankungsdauer, dem COMP-, dem DKK-1- (n jeweils 95) und dem Lysyl-Oxidase-Serumspiegel (n = 33). Ein Zusammenhang zwischen der Erkrankungsdauer dem S1P-, COMP-, DKK-1- (n jeweils 95) und dem Lysyl-Oxidase-Serumkonzentrationen (n = 33) wurde nachgewiesen. Untersuchungen der Plasmaproben von schwedischen 175 lcSSc-Patienten und 112 gesunden Probanden zeigten, dass C18:0- sowie C24:1-Ceramid und das C16:0-Dihydroceramid bei den Patienten erhöht war. Ebenso war S1P und das Glucosyl-Ceramid C24:1 lcSSc-Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe höher. Die Sphingosin-Serumspiegel waren bei den lcSSc-Patienten leicht erhöht. Erste Ergebnisse einer klinische Studie mit sieben lcSSc-Patienten, die eine vasodilatorische Therapie (Iloprost) erhielten, zeigten eine deutliche Zunahme der S1P- und dhS1P-Spiegel am Ende der Behandlung. Damit könnte sich S1P als serologischer Marker für den Behandlungserfolg nach einer Iloprost-Therapie eignen. Die hier untersuchten Sphingolipide, u. a. S1P, und sST2 unterstreichen, insbesondere unter Einbezug ihrer Serumspiegelveränderungen nach einer Iloprost-Therapie, die pathophysiologische Bedeutung der Endothelzellen bei der Sklerodermie. S1P, welches sowohl pro- als auch anti-fibrotisch agiert und zu großen Teilen in Endothelzellen produziert wird (3) und sST2, welches bereits als Marker für fibrotische Erkrankungen beschrieben wurde (4), könnten über das direkt auf Endothelzellen wirkende Iloprost modifiziert werden. Zusammenfassend lässt sich darstellen, dass sST2 und spezifische Sphingolipide neue Zielmoleküle für ein Biomarkerpanel zur exakteren und möglicherweise frühzeitigeren Diagnose der lcSSc sind und die hier dargestellten Ergebnisse deutlich auf eine Beteiligung der Sphingolipide und der IL-33/ST2-Achse in der Pathophysiologie der Sklerodermie hinweisen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The pathophysiology of systemic sclerosis (SSc) is still enigmatic. SSc is an immune-mediated systemic disease characterized by an extensive fibrosis of the connective tissue. The initial pathophysiological processes are unknown. Therefore, an early diagnosis and therapeutic intervention is complex. Endothelial cells (EC) of micro vessels are supposed to be the main site of disease onset. One of the first symptoms observed at SSc onset is a disturbed microcirculation detectable in more than 90 % of the SSc patients by the capillaroscopy (1, 2). This study focused on the potential of molecules of the sphingolipid and the Interleukin-33(IL-33)/ST2 signaling pathway as potential new serological biomarkers for SSc. Main focus was the evaluation of a biomarker (panel) for the diagnosis of SSc or the follow-up of SSc patients after medication. Sixty-nine patients with limited cutaneous SSc (lcSSc), 20 patients with diffuse cutaneous SSc (dcSSc) and ten patients in early stage of SSc (LeRoy) either from Sweden or Germany were analyzed. As control group 38 age- and gender-matched healthy individuals and eleven patients with the idiopathic, primary Raynaud’s phenomenon (1.RP) were included in this study. Capillaroscopy was performed for all German subjects. Plasma samples from 175 Swedish lcSSc patients and 112 matching healthy individuals were analyzed. Sphingolipid and glucosylceramide profiles were measured with LC-MS/MS while the protein parameters IL-33, sST2, DKK-1 and the marker for dermal fibrosis COMP and lysyl oxidase were analyzed with specific ELISA. In addition, the modified Skin score was assessed. Statistical analysis was performed with the Mann Whitney U test, the Kruskal Wallis test or the spearman’s correlation coefficient. German and Swedish lcSSc patients exhibited an lcSSc typical titer of autoantibodies. German lcSSc patients showed no anomalies in clinical chemistry and hematology. Furthermore, these 26 patients had a reduced capillary density and prominent megacapillaries in the nail fold characteristic for SSc compared to eleven 1. RP patients and three healthy individuals. Swedish patients with early stage lcSSc (n = 44) exhibited more often the early or active capillary pattern than lcSSc patients with advanced lcSSc showing the later stage of capillary alterations. IL-33 was not elevated in patients with lcSSc. Soluble ST2 was elevated in lcSSc patients with disease duration longer than nine years (n = 29) compared to dcSSc patients (n =20) or early stage lcSSc patients (disease duration one to three years, n = 15). In SSc patients (n = 95) serum sST2 levels correlated positively with disease duration. With a cytokine specific assay it could be shown that PDGF-AB/BB, IL-4, EMMPRIN, IL-1ra and ENA-78 were elevated in four lcSSc patients compared to four age- and gender-matched healthy individuals. There was a country-specific difference between German and Swedish individuals. In the German control cohort (n = 10) S1P serum levels were significantly lower than in the Swedish healthy individuals (n = 10). The analyzed ceramide levels did not differ between Swedish and German healthy subjects. Sphingosine serum levels were normalized to the mean of the corresponding control cohort and were elevated in later stages of lcSSc (disease duration one to three years, n = 15; disease duration four to nine years, n = 14) compared to 1.RP patients. S1P serum levels of SSc patients (n = 95) correlated with disease duration, COMP, DKK-1 (each n = 95) and the lysyl oxidase (n = 33) serum levels. Disease duration and S1P, COMP, DKK-1 (each n = 95) and the lysyl oxidase (n = 33) serum level had been shown. Analysis of 175 plasma samples of Swedish lcSSc patients and 112 Swedish healthy subjects demonstrated elevated levels of C18:0 and C24:1 ceramide and C16:0 dihydroceramide for the lcSSc patients. Moreover, plasma S1P and glycosyl ceramide C24:1 levels were raised compared to the control cohort. Sphingosine serum level was slightly elevated in lcSSc patients. First results of a clinical study with seven lcSSc patients receiving vasodilatory therapy (Iloprost) demonstrated an increase in S1P and dhS1P serum levels at the end of the treatment. Therefore, S1P could be a suitable serological marker for the treatment success of an Iloprost therapy. Regarding their changing serum concentrations under Iloprost therapy the analyzed sphingolipids, especially S1P, and sST2 emphasis the relevance of pathophysiological role of EC in SSc. S1P, exhibiting pro- and anti-fibrotic effects acts and being mainly produced in EC (3), and sST2, already known as biomarker for fibrotic diseases (4), may be modified by Iloprost acting directly on EC. In summary, sST2 and specific sphingolipids represent new target molecules for a biomarker panel for a more precise and potentially earlier diagnosis of lcSSc. Furthermore, the results presented here clearly indicate the involvement of sphingolipids and the IL-33/ST2 signaling pathway in the pathophysiology of SSc.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
Divisions: Study Areas
10 Department of Biology
Date Deposited: 17 Jul 2015 10:11
Last Modified: 17 Jul 2015 10:11
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-46195
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina
Refereed: 21 May 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4619
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