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Regulation der Sphingolipide und Entzündungsprozesse in immunologisch relevanten Zellen

Arlt, Olga :
Regulation der Sphingolipide und Entzündungsprozesse in immunologisch relevanten Zellen.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Regulation der Sphingolipide und Entzündungsprozesse in immunologisch relevanten Zellen
Language: German
Abstract:

An den Sphingolipid-Metaboliten sowie an ihren generierenden und produzierenden Enzymen wurde im letzten Jahrzehnt unabhängig voneinander ausgiebig geforscht. Die Sphingolipide sind in eine Vielzahl zellulärer und immunologischer, aber auch pathophysiologischer Prozesse involviert. Ein gutes Beispiel liefert das System der Lymphozyten-Wanderung entlang eines Sphingosin 1-Phosphat (S1P)-Gradienten. Hierbei werden immunmodulierende Wirkungen über das extrazelluläre S1P und dessen Bindung an die S1P-Rezeptoren ausgelöst. Diese unterscheiden sich in mancher Hinsicht von Effekten, welche durch intrazelluläres S1P innerhalb der Zellen generiert werden. Offene Fragen existieren jedoch bezüglich der Spezifität und Intensität der Wirkungen von intra- und extrazellulärem S1P auf Immunzellen. Aufgrund der Hinweise über pro-inflammatorische Effekte des intrazellulären S1P, gegenüber denen des extrazellulären S1P, wurden in der vorliegenden Arbeit zunächst die Ersteren in murinen dendritischen Zellen (DCs) des Immunsystems untersucht. Die Analysen basierten auf einer TNF-α-Ko-Stimulation sowie Untersuchungen der dadurch hervorgerufenen Zytokin-Produktion. Tendenziell war der zelluläre Einfluss von S1P von dessen extrazellulär-anti-inflammatorischen Effekten kaum unterscheidbar gewesen. Aus diesem Grund wurden des Weiteren die bekannten Effekte des extrazellulären S1P zunächst verifiziert und erweitert, so dass spezifische S1P-neutralisierende Spiegelmere eingesetzt werden konnten. Da diese den Effekt auf das pro-inflammatorische Zytokin schwach umkehren konnten, war nun die stimulationsbedingte Regulation der S1P Lyase, welche S1P irreversibel degradiert, von besonderem Interesse. Lediglich eine geringe Anzahl an Publikationen konnte bisher eine detailgetreue zusammenhängende Analyse der Sphingolipide und deren Enzyme in Immunzellen beschreiben. Die hier vorliegenden Studien wurden ebenfalls in immunkompetenten dendritischen Zellen, welche Pathogenstrukturen durch keimbahnkodierende Rezeptoren erkennen und durch Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine T-Zellen aktivieren, bewerkstelligt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass eine klassische pro-entzündliche Stimulation solcher keimbahnkodierender Rezeptoren auf DCs nicht nur einen Zytokinsturm veranlasst, sondern auch gravierende Veränderungen der S1P Lyase sowie anderer untersuchten S1P-relevanten-Enzyme auf mRNA-Ebene mit sich bringt. Die Regulation der Enzyme wurde über die gesamte Lebensspanne der aktivierten und ruhenden DCs in vitro untersucht. Begleitet wurden die Analysen durch Messungen der zellulären Konzentrationen des entscheidenden S1P und Sphingosin (der Vorgänger des S1P im Sphingolipid-Metabolismus). Diese beiden Metaboliten können durch reversible katalytische Aktivität der Enzyme ineinander übergehen, um in der Zelle eine höchst erforderliche Balance zu erhalten. Nach einer längeren (beinahe chronischen) Aktivierung der DCs wird diese Balance jedoch in Richtung der zellulären Sphingosin-Akkumulation massiv beeinträchtigt und letztendlich begeht die Zelle einen sogenannten aktivierungs-induzierten Zelltod (AICD), welcher auch in T-Zellen beschrieben wurde. Die Messung der Apoptose hat den maßgebenden Einfluss der gestörten Sphingolipid-Balance in DCs bestätigt. Auch wenn die S1P Lyase nach der DC-Aktivierung reduziert war, sowohl auf mRNA- als auch auf Aktivitätsebene, konnte in den Zellen ein Anstieg des S1P ausgeschlossen werden. Da S1P durch aktiven Transport in den Extrazellularraum gelangen kann, wurde dieser Transport im DC-System für möglich gehalten. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal die durch eine klassische entzündliche Reaktion der DCs hervorgerufene spezifische und sensitive Regulation der Sphingolipid-Enzyme mit AICD in Verbindung gebracht. Diese Befunde sollten in der Zukunft bei der Entwicklung von weiteren Medikamenten und Therapien zur Bekämpfung, beispielweise von Krebs-Erkrankungen, berücksichtigt werden. Diese Arbeit konnte zudem aufdecken, dass vorliegende physiologische intra- und extrazelluläre S1P-Mengen einander ständig beeinflussen und nicht voneinander abgegrenzt werden können, da neu gebildetes S1P aktiv aus der Zelle heraustransportiert werden kann. Für zukünftige Analysen der Effekte beider lokalisationsbedingter S1P-Typen empfiehlt es sich sowohl den Auswärtstransport als auch die Rezeptoren zu antagonisieren, zu blockieren oder defiziente Mäuse zu verwenden. Für den letzteren Fall wurde kürzlich ein Mausmodell generiert, mit dessen Hilfe die S1P Lyase spezifisch und zum erforderlichen Zeitpunkt ausgeschaltet werden kann. Diese Arbeit hat des Weiteren entscheidend dazu beigetragen die Vorgehensweise der S1P Lyase-Defizienz zukünftig in vivo anzuwenden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
In the last decade huge progress has been made regarding research in sphingolipid metabolites and the respective enzymes. Sphingolipids are implicated in many cellular, immunological and pathophysiological processes. A well-known immune modulatory function of extracellular Sphingosine 1-phosphate (S1P) through its binding to the S1P receptors is that for lymphocyte trafficking along the S1P gradient. This differs from effects, which are usually generated by intracellular S1P within the cells. Hence there are still some open questions regarding specificity and intensity of the properties made by extra- vs. intracellular S1P in immune cells. Because of existing evidence about pro-inflammatory effects of intracellular S1P, in this work they were analyzed in murine dendritic cells (DCs). The studies are based on co-stimulation with TNF-α and the examination of resulting cytokine production. The influence of intracellular S1P could be barely distinguished from that of extracellular S1P, which plays an anti-inflammatory role in dendritic cells. Therefore the already established effects of extracellular S1P were verified and expanded. Thereafter, specific S1P-neutralizing Spiegelmers were applied, which marginally rescued the immune modulatory effects made by intracellular S1P. Because of these results, we next analyzed the regulation of S1P lyase after cell stimulation. This enzyme degrades S1P irreversibly and is if high interest. There exist only few publications that describe a detailed cohesive analysis about sphingolipids and the respective enzymes in immune cells. The studies in this work were also carried out in immune competent dendritic cells, which recognize pathogen associated molecular patterns by their conserved receptors and secrete pro-inflammatory cytokines to activate T-cells. This work showed that a classical inflammatory stimulation of these receptors on DCs results not only in a cytokine storm but also implicates serious changes in the expression of S1P lyase and other S1P-relevant enzymes on mRNA level. The regulation of the enzymes was examined over the life time of matured but inactive or of TLR-activated DCs in vitro. These studies were accompanied by measurements of cellular concentrations of S1P and sphingosine (the precursor of S1P in the metabolic sphingolipid pathway). These two metabolites are reversibly converted into each other and the respective enzymes maintain an essential balance between S1P and sphingosine inside the cells. After a long-time (almost chronic) activation of DCs this balance is affected due to sphingosine accumulation, which results in activation-induced cell death (AICD), which has been extensively described for T-cells. The impact of destroyed sphingolipid balance could be further confirmed by analysis of cell apoptosis. Despite the activation-induced reduction of S1P lyase on mRNA and enzyme activity level, an increase in intracellular S1P concentration was excluded. S1P can be actively transported out of the cell. Therefore, in the described DC system it is possible that S1P ends up in the extracellular space through transporters. This work for the first time associates a classical inflammatory reaction of DCs with a specific and sensitive regulation of the sphingolipid enzymes and AICD. In the future, these findings should be considered for development of drugs and therapies against cancer. Furthermore, this work showed that physiological extra- and intracellular S1P concentrations influence each other and cannot be distinguished from each other, because of the transportation of produced S1P out of the cell. For future analysis of both location-dependent S1P types the transporters and receptors could be antagonized or blocked. Otherwise the usage of deficient mice is suggested. Recently, a mouse model was generated to specifically and time-dependently knock out the S1P lyase in mice. This work moreover contributed to the application procedure of this mouse model.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Study Areas
10 Department of Biology
Date Deposited: 25 Jun 2015 10:22
Last Modified: 25 Jun 2015 10:22
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-46048
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Cardoso, Prof. Dr. M. Christina and Radeke, Prof. Dr. Heinfried H.
Refereed: 21 May 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4604
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