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Molekularbiologische und physiologische Untersuchungen zum Phosphattransport bei Geosiphon pyriformis

Volz, Frank :
Molekularbiologische und physiologische Untersuchungen zum Phosphattransport bei Geosiphon pyriformis.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2004)

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Ergebnisse, Diskussion, Literaturverzeichnis - PDF
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Molekularbiologische und physiologische Untersuchungen zum Phosphattransport bei Geosiphon pyriformis
Language: German
Abstract:

Phosphat als ein für die Pflanzen essentielles Element wird von diesen in den meisten Fällen über symbiotische Mykorrhizapilze aufgenommen, die an bzw. in den Wurzeln von ca. 80 - 90 % aller Landpflanzen (SMITH & READ, 1997) leben. Das Untersuchungsobjekt der vorliegenden Arbeit, Geosiphon pyriformis, stellt insofern eine Besonderheit dar, als es einerseits als ein ursprünglicher Vertreter der arbuskulären Mykorrhizapilze (AM-Pilze) einzustufen ist (u. a. SCHÜßLER ET AL., 2001; SCHWARZOTT ET AL., 2001), andererseits aber eine Endosymbiose mit dem Cyanobakterium Nostoc punctiforme eingeht. Geosiphon pyriformis kann aus verschiedenen Gründen als Modellsystem für die AM angesehen werden, vor dem Hintergrund der speziellen Anpassung der Symbiose Geosiphon pyriformis an Phosphat-Mangelbedingungen sollten die molekularen und physiologischen Mechanismen der Aufnahme von Phosphat und ggf. anderer Nährstoffe untersucht und mit denen der AM-Pilze verglichen werden. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnte aus Geosiphon pyriformis eine genomische DNA-Genbank aufgebaut und so eine von den schwierigen Kulturen der Symbiose unabhängige Grundlage für die Bearbeitung weiterer molekularbiologischer Fragestellungen gelegt werden. Aus dieser Genbank konnten sowohl ein 340 bp langes Teilfragment eines Gens für einen high-affinity Phosphattransporter, als auch ein 463 bp langes Teilfragment eines bakteriellen Gens für einen ABC-Typ-Hexosetransporter amplifiziert und charakterisiert werden. Die weitere Analyse des Phosphattransporter-Genfragments im Vergleich zu anderen pilzlichen und pflanzlichen Phosphattransportergenen zeigte, dass die Divergenz der Gensequenzen innerhalb des Reiches der Pilze deutlich größer war als zwischen Pflanzen. So waren die berechneten genetischen Distanzen von pilzlichen Genen, deren Genprodukten die gleichen Funktionen und ähnliche Substratspezifität zugeschrieben werden, erheblich größer als die Distanzen zwischen pflanzlichen Genen aus einer Art, deren Genprodukte deutlich unterschiedliche Substratspezifität aufweisen. Erstmals konnte innerhalb eines genomischen DNA-Fragments eines pilzlichen Phosphattransportergens eine mögliche Intronsequenz charakterisiert werden. Das hier charakterisierte bakterielle Zuckertransporter-Genfragment konnte im Rahmen einer innerhalb dieser Dissertation angeleiteten Diplomarbeit den in Sporen und Hyphen von AM-Pilzen lebenden „bacteria-like organisms“ (BLOs) von Geosiphon pyriformis zugeordnet werden. Die zu diesem Zweck zusätzlich durchgeführte Analyse der 16 S-rRNA-Gene führte zu grundlegenden Hinweisen über die taxonomische Stellung der BLOs von Geosiphon pyriformis innerhalb des Reichs Bacteria. Zur weiteren Analyse des Phosphatmetabolismus der Symbiose Geosiphon pyriformis wurden 32Pi-Tracerexperimente durchgeführt und diskutiert, die zur Etablierung der Methode und ersten Aussagen bezüglich der unterschiedlichen Stoffwechselreaktionen der Symbiose und der Symbiosepartner in Abhängigkeit von den Versuchsbedingungen führten. So ist eine hohe Substrataffinität des Pi-Aufnahmesystems von Geosiphon pyriformis wahrscheinlich, da die Aufnahme des Tracers aus einer Lösung mit extrem niedrigem Phosphatgehalt (max. 5,4 nM) nachgewiesen werden konnte. Die übrigen Experimente wurden bei einem Gesamtphosphatgehalt von 10 µM durchgeführt. Insbesondere die Pulse-Chase-Experimente zeigten erhebliche Unterschiede zwischen Blasen von Geosiphon pyriformis und freilebenden Zellen des Endosymbionten Nostoc punctiforme auf. So erfolgte die Weitergabe des Tracers aus dem Pi-Pool der Blasen erheblich schneller und an eine größere Zahl von Metaboliten. Im Vergleich der Applikation des Tracers im Licht bzw. im Dunkeln bei Geosiphon-Blasen zeigten sich deutlich höhere Markierungen bei Produkten des Calvin-Zyklus im Licht, die auf die photosynthetisch aktiven endosymbiontischen Nostoc-Zellen zurückgeführt werden konnten. Bei der genauen Bestimmung der Substrataffinität sowie anderer Kenngrößen des Phosphatstoffwechsels blieben allerdings noch viele Fragen offen. Insbesondere scheiterten wiederholt Versuche am mangelnden Versuchsmaterial, da die Kultur der Symbiose Geosiphon pyriformis sich nach wie vor als äußerst schwierig erwies.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Phosphate is an essential element which in most cases is taken up via symbiotic mycorrhizal fungi living at or within the roots of 80 - 90 % of all land plants (SMITH & READ, 1997). On one hand the research object of this work, Geosiphon pyriformis, has been shown to be a basal member of the arbuscular mycorrhizal fungi (e. g. SCHÜßLER ET AL., 2001; SCHWARZOTT ET AL., 2001), on the other hand it builds up an endosymbiosis with the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Geosiphon pyriformis is in this way very special and for different reasons can be used as a model system for arbuscular mycorrhiza (AM). The endosymbiosis Geosiphon pyriformis depends on low phosphate conditions, thus the molecular and physiologic mechanisms of phosphate-uptake and the uptake of other nutrients should be examined and compared to those of other AM-fungi. In the first step of the experimental work of this dissertation a genomic DNA-library of Geosiphon pyriformis was built up. In this way molecular experiments became independent from the still difficult and labile culture system of Geosiphon pyriformis. From this genomic DNA-library a 340 bp fragment of a high-affinity phosphate transporter gene and a 463 bp fragment of a bacterial gene with high homology to an ABC-type hexose transporter could be isolated and characterized. Further analysis of the phosphate transporter fragment in comparison to fungal and plant phosphate transporter genes showed a higher gene divergence within the kingdom of fungi compared to plants. It could be shown that the calculated genetic distances between fungal genes coding for proteins of similar function and substrate affinity were higher than the genetic distance of plant genes of the same species but with different substrate affinity. For the first time, a putative intron could be characterized within a AM-fungal genomic DNA fragment. The results of a diploma thesis instructed within this dissertation showed clearly, that the bacterial hexose transporter fragment belongs to the ”bacteria-like organisms” (BLOs) of Geosiphon pyriformis. BLOs are wide-spread within spores and hyphae of all AM-fungi. The taxonomic position of the BLOs of Geosiphon pyriformis within the kingdom Bacteria was analyzed by characterization of their 16 S rRNA-gene and calculation of phylogenetic trees. For further analysis of the phosphate metabolism of the symbiosis Geosiphon pyriformis 32Pi tracer experiments were carried out and discussed. Optimization of the experimental set-up led to first results of different metabolic reactions of the symbiosis itself and symbiotic partners depending on different experimental conditions. It could be shown, that Geosiphon pyriformis has a high substrate affinity of the P-transport system, as the radioactive tracer was taken up from a solution of very low phosphate concentration (5,4 nM). All other experiments were carried out at a phosphate concentration of 10 µM. Especially the pulse-chase experiments showed great differences between the phosphate metabolism of bladders of Geosiphon pyriformis and free-living cells of the endosymbiont Nostoc punctiforme. Within the bladders the radioactive tracer from the Pi-pool was transferred more rapidly and to a greater number of metabolites. The application of the tracer in light and darkness was compared. It could be shown, that in light the tracer was transferred to products of the Calvin-cycle in a greater amount than in darkness. As it has previously been shown that the endosymbiotic Nostoc-cells are active in photosynthesis (KLUGE ET AL., 1991), this is due to the activity of carbon assimilation of the cyanobacteria. Many questions remain still open in characterization of the substrate affinity of the phosphate transport system and other key values of the phosphate metabolism. Many experiments could not be carried out due lack of material, as the cultures of the symbiosis Geosiphon pyriformis are still labile and difficult to handle.English
Uncontrolled Keywords: Geosiphon pyriformis; hochaffines Phosphattransportergen; 32P-Tracerexperimente; Dünnschichtchromatographie; 2D-DC
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
Geosiphon pyriformis; hochaffines Phosphattransportergen; 32P-Tracerexperimente; Dünnschichtchromatographie; 2D-DCGerman
Geosiphon pyriformis; high-affinity phosphate transporter gene; 32P tracer experiments, thin layer chromatography, 2D-TLCEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:21
Last Modified: 07 Dec 2012 11:50
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000459
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-4592
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Kluge, Prof. Dr. Manfred and Ullrich, Prof. Dr. Wolfram
Advisors: Kluge, Prof. Dr. Manfred and Schüßler, PD Dr. hab Arthur and Gehrig, Dr. habil. Hans
Refereed: 14 May 2004
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/459
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