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Entwicklung und Charakterisierung einer photoschaltbaren Histondeacetylase-ähnlichen Amidohydrolase

Korbus, Michael :
Entwicklung und Charakterisierung einer photoschaltbaren Histondeacetylase-ähnlichen Amidohydrolase.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Entwicklung und Charakterisierung einer photoschaltbaren Histondeacetylase-ähnlichen Amidohydrolase
Language: German
Abstract:

Die Kontrolle von Enzymen durch einen externen Lichtstimulus ermöglicht eine präzise, orts- und zeitaufgelöste Steuerung definierter chemischer Reaktionen und demnach die Katalyse bestimmter Substrate. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Charakterisierung eines reversibel photoschaltbaren Biokatalysators, einer Histondeacetylase-ähnlichen Amidohydrolase (HDAH) von Bordetella/Alcaligenes Stamm FB188, welcher in einen aktiveren oder inaktiveren Zustand durch cis/trans Photoisomerisierung eines kovalent angekoppelten monofunktionalen Azobenzol-Maleimid-Derivats (4-Phenylazomaleinanil; 4-PAM) überführt werden konnte. Das lichtschaltbare Element, 4-PAM, wurde selektiv und ortsspezifisch an unterschiedlich positionierte Cysteinreste nahe der Aktivkanaleintrittsfläche angekoppelt und die sterische Blockierung des Aktivkanaleingangs anhand von Michaelis-Menten Parametern (Km und Vmax) quantifiziert. In diesem Zusammenhang konnten drei photoschaltbare HDAH-Varianten entwickelt werden (HDAH S20C, M30C und M150C), die sich in ihrer Photoschaltungseffizienz (M30C > S20C > M150C) unterschieden. Die maximal erreichbare Photoschaltungseffizienz betrug 50 % (HDAH M30C), wobei die cis-Konfiguration die HDAH aktivierte und die trans-Konfiguration zu einer Inaktivierung führte. Darüber hinaus konnte die HDAH-Aktivität in mehreren alternierenden UV/VIS-Bestrahlungszyklen ohne Einflussnahme auf die Enzymaktivität photogeschaltet und während sowie nach dem Photoschaltungsprozess keine Photozerstörung von 4-PAM nachgewiesen werden. In Bezug auf die thermische cis-zu-trans Relaxation von nicht-modifizierten 4-PAM (einphasige Kinetik) konnte an den 4-PAM/HDAH-Variant Konjugaten eine außergewöhnlich starke Verlangsamung der Relaxationsgeschwindigkeit (zweiphasige Kinetik) festgestellt werden, welche im Maximum (HDAH M30C) um das ~ 50-fache (t1/2 = ~ 30 h) reduziert wurde. Dieses besondere Merkmal ermöglichte die initiale Aktivierung des 4-PAM/HDAH-Konjugats durch einen einzigen Lichtpuls und die Aufrechterhaltung des enzymatisch aktiveren Zustands ohne kontinuierliche UV-Bestrahlung. Als Ursache für die starke Verlangsamung der cis-zu-trans Relaxation wurde eine Stabilisierung der cis-Konfiguration oder dessen Übergangszustandes an der Proteinoberfläche angenommen. Dies konnte anhand von MD-Simulationen sowie einer dazu systematischen Mutagenese-Studie an der HDAH S20C-Variante bestätigt werden. Hierbei wurde vor allem ein prominentes Histidin (H35) identifiziert, welches für die außerordentliche Stabilisierung verantwortlich war sowie die Beteiligung eines hydrophoben Clusters, bestehend aus den Aminosäuren L21, L37, P274 und L275, dessen Koordination eine essentielle Rolle in der Aufrechterhaltung der maximalen Photoschaltungseffizienz darstellte. Als involvierte intermolekulare Interaktionen zwischen dem an HDAH angekoppelten 4-PAM und relevanten Aminosäuren konnten polare, hydrophobe und vermutlich aromatische π-π Wechselwirkungen abgeleitet werden. Eine signifikante Verbesserung der Photoschaltungseffizienz der HDAH-M30C Variante (50 %) konnte durch die neuartig synthetisierten Azobenzolalkyl-Maleimid-Derivate (AMD), die Alkylspacer erweiterte 4-PAM Moleküle darstellen, nicht erzielt werden. Im Gegenzug wurde ein Alkylspacerlängen-abhängiges Verhalten auf die Enzymaktivität beobachtet, wobei AMD 1a zu einem enzymatisch inversen Schaltverhalten (trans = aktiver, cis=inaktiver) und AMDs mit Alkylspacern ≥ 3 zu einer nahezu vollständigen Inhibierung der HDAH-Aktivität führten. Ergänzend zu den photoschaltbaren Vmax-Werten zeigten die Km-Werte ebenfalls eine signifikante Photokontrolle. Darüber hinaus konnten, im Vergleich zu dem anerkannten HDAC/HDAH-Inhibitor SAHA, alle in dieser Arbeit getesteten Azobenzolderivate (4-PAM und AMD 1a-e) und dessen Isomere als nicht-potent inhibitorische Substanzen eingestuft werden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The control of enzymes by an external light stimulus enables a precise and spatiotemporal regulation of defined chemical reactions and hence the catalysis of specified substrates. The present thesis describes the development and characterization of a reversible photoswitchable biocatalyst, a histone deacetylase-like amidohydrolase (HDAH) from Bordetella/Alcaligenes strain FB188, which could be converted into a more active or less inactive state by cis/trans photoisomerization of a covalently attached monofunctional azobenzene-maleimide-derivative (4-phenylazomaleinanil; 4-PAM). The photoswitchable element, 4-PAM, was selectively and site-specifically conjugated to different cysteine residues close to the entry of the active site area and the steric hindrance quantified by Michaelis-Menten parameters (Km and Vmax). In this context, three photoswitchable HDAH variants were developed (HDAH S20C, M30C and M150C), which showed different photoswitching efficiencies (M30C > S20C > M150C). The highest photoswitching efficiency was determined to be 50 % (HDAH M30C) whereupon the cis-configuration showed an activation and the trans-configuration showed an inactivation of the HDAH activity. Furthermore, it could be shown that the HDAH activity was reversibly photoswitched by multiple and alternating UV/VIS cycles of irradiation without any influence on the HDAH activity. In addition, no photodestruction of 4-PAM was observed during and after the photoswitching process. Referring to the thermal cis-to-trans relaxation of unmodified 4-PAM (one-phase kinetic) the 4-PAM/HDAH variant conjugates showed extremely decreased relaxation rates (two-phase kinetic), which were reduced maximally (HDAH M30C) up to ~ 50-fold (t1/2 = ~ 30 h). This special feature enabled the initial activation of the 4-PAM/HDAH conjugate by a single light pulse and the maintenance of the enzymatic active state without the need of permanent UV irradiation. In consideration of the strong reduction of the cis-to-trans relaxation, a stabilization of the cis-configuration or its transition state on the protein surface was proposed. This presumption was confirmed by MD-simulations and a systematically performed site-directed mutagenesis study, realized for the HDAH S20C variant. In this context, a prominent histidine (H35) could be identified, which was responsible for the exceptional stabilization as well as the involvement of a hydrophobic cluster, composed of the amino acids L21, L37, P274 and L275, whose coordination was essential for the maintenance of the photoswitching efficiency at its maximum. Concerning intermolecular interactions between the conjugated 4-PAM molecule and relevant amino acids of HDAH, polar, hydrophobic and presumably aromatic π-π interactions could be deduced. A significant improvement of the photoswitching efficiency for the HDAH-M30C variant (50 %) by using novel synthesized azobenzenealkylmaleimide derivatives (AMD), which represent an extension of the 4-PAM molecule by a defined alkyl spacer length, could not be achieved. However, an alkyl spacer dependent behavior could be observed in terms of the enzyme activity whereupon AMD 1a showed an inverse photoswitching behavior (trans = more active, cis = less inactive). AMDs with an alkyl spacer length ≥ 3 led to an almost complete inhibition of the HDAH activity. In addition to the photoswitchable Vmax-values, Km-values were also photocontrolled significantly. Moreover and with regard to the accepted HDAC/HDAH inhibitor SAHA, in this thesis all tested azobenzene derivatives (4-PAM and AMD 1a-e) and its isomers could be classified as non-potent inhibitory compounds. English
Place of Publication: Darmstadt
Uncontrolled Keywords: Deacetylierung, Photoschaltung, intermolekulare Interaktionen
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
Deacetylation, photoswitch, intermolecular interactionsEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie
07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 15 May 2015 10:40
Last Modified: 15 May 2015 10:40
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-45405
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Meyer-Almes, Prof. Dr. Franz-Josef and Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Schmitz, Prof. Dr. Katja
Refereed: 24 March 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4540
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