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Effects of ionizing radiation on cell-matrix interactions at the single molecule level

Lauer, Florian :
Effects of ionizing radiation on cell-matrix interactions at the single molecule level.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Effects of ionizing radiation on cell-matrix interactions at the single molecule level
Language: English
Abstract:

Single molecule microscopy is a technology that allows for accurate assessment of the location and motion of single fluorescent molecules, even in the context of observations on living biological samples. In the present thesis, a flexible analysis tool for single molecule data as obtained in biological experiments was established. The development of a tool to faithfully detect and localize diffraction-limited images of individual fluorescent probes was necessary since data acquired under cell cultivation conditions that account for a three-dimensional microenvironment as experienced physiologically by cells in native tissue poses a challenge not faced ordinarily. After design, implementation, quantitative tests using simulations for comparisons and verification, and evaluation of the different steps of the analysis procedure including local background estimation, local noise estimation, de-noising approaches, detection, localization, and post-processing, analysis capabilities were utilized to evaluate the impact of x-ray irradiation on the plasma membrane architecture of U2OS human osteosarcoma cells as assessed by tracking individual fluorescent lipid-mimetic dye molecules diffusing in the outer membrane leaflet. It was shown that lateral diffusion in the plasma membrane is well described as two-phase anomalous subdiffusion and presence of 3D extracellular matrix leads to lower anomalous exponents of the fast fraction in comparison to monolayer cell culture. Interestingly, even high single-dose (25 Gy) treatments known to induce membrane-mediated apoptosis in tumor microvessel endothelium via membrane viscosity enhancing ceramide generation were not observed to alter membrane architecture in U2OS cells which can be related to amplifying, feedback-driven redox-signaling in the endothelium absent in U2OS. In summary, the sensitive and accurate framework developed in this thesis to assess minute changes of plasma membrane located dynamic processes did not uncover a marked influence of ionizing radiation on plasma membrane lipid dynamics per se. However, it lays the major foundation to allow for studies of receptor signalling pathways with the same accuracy in the context of physiologically meaningful 3D microenvironments.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Einzelmolekülmikroskopie ist eine Technik, die das genaue Lokalisieren und Verfolgen der Bewegung einzelner fluoreszenter Moleküle – sogar bei der Betrachtung lebender biologischer Proben – erlaubt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein flexibles Analysewerkzeug für Einzelmoleküldaten, wie sie Ziel von biologischen Experimenten sind, etabliert. Dies war notwendig, um unter Zellkulturbedingungen, die einer dreidimensionalen Mikroumgebung, wie Zellen physiologisch im nativen Gewebe erfahren, Rechnung tragen und dabei eine besondere Herausforderung darstellen, zuverlässig fluoreszente Sonden zu detektieren und zu lokalisieren. Nach Konzipierung, Implementierung, Testsimulationen für quantitativen Vergleich und zur Verifikation, sowie der Evaluierung der unterschiedlichen Schritte der Analyseprozedur inklusive der Bestimmung des lokalen Hintergrundes, des lokalen Bildrauschens, Entrauschung, Detektion, Lokalisierung and zuletzt Nachbearbeitung des Datensatzes wurden diese Analysefähigkeiten angewandt um durch das Verfolgen einzelner lipidähnlicher Farbstoffmoleküle im äußeren Blatt der Plasmamembran humaner U2OS Osteosarkomzellen den Einfluss von Röntgenbestrahlung auf die Architektur der Plasmamembran zu bestimmen. Es konnte gezeigt werden, dass die laterale Diffusion in der Plasmamembran durch zwei Phasen mit jeweils anomaler Diffusion gut beschrieben wird und dass bei Gegenwart einer 3D extrazellulären Matrix die anomalen Exponenten der schnellen Fraktion verringert werden im Vergleich zur gewöhnlichen 2D Zellkultur. Interessanterweise wurden auch nach hohen Einzeldosen (25 Gy), bei denen bekannt ist, dass sie über membranviskositäterhöhende Ceramiderzeugung membranvermittelte Apoptose im Tumor-Mikrogefäßendothel induzieren, keine Änderungen der U2OS-Plasmamembran beobachtet. Dies kann man beziehen auf die Abwesenheit von endotheliumtypischen, rückkoppelnd-verstärkenden Redox-Signalwegen in U2OS-Zellen. Zusammengefasst, konnte die empfindliche und präzise Analysestruktur, die in der vorliegenden Arbeit entwickelt wurde, um kleinste Veränderungen dynamischer Prozesse in der Plasmamembran aufzudecken, keine merklichen Einfluss ionisierender Strahlung auf die Lipiddynamik an sich in der Plasmamembran feststellen. Andererseits setzt sie das Fundament für Studien zu Rezeptorsignalwegen im Kontext physiologisch sinnvoller Mikroumgebungen mit der selben Genauigkeit.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
Divisions: 05 Department of Physics
Date Deposited: 06 May 2015 06:20
Last Modified: 06 May 2015 06:20
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-45336
Referees: Durante, Prof. Dr. Marco and Meckel, PD Dr. Tobias
Refereed: 20 April 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4533
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