TU Darmstadt / ULB / TUprints

Theoretische und experimentelle Methoden zur Verbesserung der Unterscheidbarkeit alternativer Modelle der Proteinrekrutierung

Lengert, Laurin :
Theoretische und experimentelle Methoden zur Verbesserung der Unterscheidbarkeit alternativer Modelle der Proteinrekrutierung.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

[img]
Preview
Text
Dissertation_Laurin_Lengert.pdf
Available under Creative Commons Attribution Non-commercial No-derivatives 3.0 de.

Download (3MB) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Theoretische und experimentelle Methoden zur Verbesserung der Unterscheidbarkeit alternativer Modelle der Proteinrekrutierung
Language: German
Abstract:

Die Möglichkeit zur fluoreszenten Markierung von Proteinen ist eine der herausragendsten Entwicklungen der Biologie in den letzten Jahrzehnten. Hierdurch ist es möglich, zuvor ungeahnte Einblicke in die fundamentalen Abläufe des Lebens, etwa der Zellvermehrung, der DNA-Reparatur und der Kommunikation mit anderen Zellen, zu gewinnen. Um aus den Daten von Experimenten mit fluoreszierenden Proteinen die chemischen Ratenkonstanten und weiterführende Informationen zu gewinnen, werden standardmäßig mathematische Modelle verwendet. Für ein gegebenes Experiment bieten sich dabei zumeist mehrere miteinander konkurrierende Modelle an. Um in einer derartigen Untersuchung letztlich zu aussagekräftigen Ergebnissen zu gelangen, ist es entscheidend, dass zwischen den Modellen anhand ihrer Fähigkeit zur Reproduktion der Daten unterschieden werden kann. Allerdings ist diese Unterscheidbarkeit häufig aufgrund der mangelnden Spezifität der experimentellen Daten oder der zu hohen Anpassungsfähigkeit der Modelle an die Daten nicht gegeben.

Da die Unterscheidbarkeit zwischen alternativen Modellen derart bedeutend für den Erkenntnisgewinn aus einer Untersuchung ist, befasst sich diese Arbeit daher mit verschiedenen, sowohl theoretischen als auch experimentellen Methoden, mit denen die Unterscheidbarkeit zwischen Modellen erhöht werden kann. Dabei werden solche Modelle untersucht, die der Beschreibung der Proteinrekrutierung innerhalb einer Zelle nach einem auslösenden Ereignis, wie etwa nach DNA-Schäden erzeugender Bestrahlung mit einem Laser, dienen.

Im ersten Teil wird auf rein theoretischer Basis eine Methode entwickelt, die auf dem Vergleich spezifischer Merkmale von Proteinrekrutierungskurven aufbaut. Diese Methode soll unter anderem Experimentatoren dabei helfen, anhand ihnen vorliegender experimenteller Daten eine Vorauswahl der zur Datenanalyse verwendeten Modelle zu treffen und hierdurch den Arbeitsaufwand der Datenanalyse zu reduzieren. Zusätzlich können die Erkenntnisse aus dem ersten Teil auch bei der Planung eines Experiments sehr hilfreich sein, da sie Aufschluss darüber geben, welche Zeitfenster während der Proteinrekrutierung für die Identifizierung oder den Ausschluss eines bestimmten Modells ausschlaggebend sind.

Im zweiten Teil der Arbeit wird eine Methode vorgestellt, die auf der Verwendung von FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching) zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Proteinrekrutierung basiert. FRAP ist eine Standardmethode, die unter anderem der Untersuchung der chemischen Ratenkonstanten der Proteine dient. In der hier vorgestellten Weiterentwicklung der FRAP-Methode werden zwei Laser verwendet, wobei der erste Laser der Erzeugung von DNA-Schäden dient und der Zweite dem Bleichen der fluoreszierenden Proteine. Dies führt zum einen zu einer deutlichen Verbesserung der Unterscheidbarkeit der Modelle. Zum anderen ist es dank dieser Methode auch möglich, Prozesse zu untersuchen, während deren Dauer sich die chemischen Ratenkonstanten der Proteine ändern. Hierdurch unterscheidet sich die hier vorgestellte Methode wesentlich von klassischen FRAP-Analysen und ermöglicht damit die Untersuchung von noch unerforschten, aus wissenschaftlicher Sicht sehr interessanten Abläufen.

Der dritte Teil dieser Arbeit untersucht auf rein theoretischer Basis den Einfluss des zeitlichen Abstandes zwischen der Bestrahlung zur Erzeugung von DNA-Schäden und der Verwendung des zweiten Lasers zum Bleichen der Proteine. Diese Untersuchung kommt zu dem Schluss, dass eine Kombination verschiedener zeitlicher Abstände die Unterscheidbarkeit der alternativen Modelle deutlich verbessert.

Die für zukünftige Experimente entscheidende Botschaft dieser Arbeit besteht zusammenfassend in der Aussage, dass die Durchführung von FRAP-Experimenten zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Proteinrekrutierungskurve die Unterscheidbarkeit zwischen alternativen Modellen und damit die Wahrscheinlichkeit für aussagekräftige Ergebnisse wesentlich erhöht.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The use of fluorescently labeled proteins is one of the most exciting advances of biology during the past decades. It enables previously unimagined insights into the fundamental processes of life itself like cell proliferation, DNA repair and intercellular communication. In order to extract the chemical rate constants and further informations from experiments with fluorescent proteins usually mathematical models are used. For a given experiment often several competing models are apposite. For attaining meaningful results in such a study the discriminability between the models with regard to their ability to reproduce the data is vital. However, often the models are indiscriminable due to the data lacking in specifity or the models adaptability to the data. Since the discriminability between alternative models is of such importance for the insights gained from an investigation this thesis deals with theoretical and experimental methods which help improving the discriminability between models. The models used will describe the protein recruitment in a cell following a triggering event, such as DNA damage induced by laser irradiation. In the first part a purely theoretical method will be introduced, which is based on the comparison of specific features of theoretical protein recruitment curves. Among other things, this method is meant to help experimentalists preselecting a model used for data analysis depending on the experimental data thereby reducing the effort of data analysis. Additionally, the insights of this thesis can serve the planning of an experiment, since they give indication of the time frames during protein recruitment that are of crucial importance for the identification or the exclusion of a given model. In the second part of this thesis a method is presented that relies on the use of FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching) at different time points during the recruitment phase. FRAP is a standard method used, inter alia, for measuring the chemical rate constants of the proteins. In the method introduced in this thesis two lasers are used with the first laser inducing DNA lesions and the second laser bleaching the fluorescent proteins. Due to this procedure the discriminability between the models is greatly enhanced. Additionally, this method allows to investigate processes during which the chemical rate constants of the proteins change over time, a situation to which classical FRAP analysis is not applicable. Hence, this advantage enables researching yet unexplored processes of great scientific interest. In the third part the influence of the time point at which the recruited proteins are bleached on the discriminability between the models is investigated. It is shown that a combination of different time points remarkably improves the model's discriminability. For future experiments the most important insight of this work is that conducting FRAP at different time points during the protein recruitment phase greatly enhances the discriminability between alternative models thereby increasing the probability of meaningful results.English
Place of Publication: Darmstadt
Uncontrolled Keywords: FRAP, Mikrobestrahlung, DNA Reparatur, Kinetische Modelle
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
FRAP, microirradiation, DNA repair, PCNA, kinetic modelEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Computational Biology and Simulation
10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
05 Department of Physics
05 Department of Physics > Institute for condensed matter physics > Bio Physics
Date Deposited: 13 Feb 2015 08:13
Last Modified: 13 Feb 2015 08:13
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-44001
Referees: Drossel, Prof. Dr. Barbara and Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina
Refereed: 18 December 2014
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4400
Export:
Actions (login required)
View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year