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In Silico Strategies to Modulate DNA Damage Response

Knorr, Sabine :
In Silico Strategies to Modulate DNA Damage Response.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: In Silico Strategies to Modulate DNA Damage Response
Language: English
Abstract:

The objective of this work was the investigation of DNA damage response in irradiated tumor cells at molecular level. Using different computational (in silico) approaches three proteins and protein complexes relevant to radiation biology were analyzed in terms of structural-dynamic and evolutionary aspects. Inhibition of the 20S proteasome was shown to selectively sensitize tumor cells to radiation-induced DNA damage in contrast to surrounding healthy tissue. Thus proteasome inhibitors have a great potential as radiosensitizing agents. Simulation of the enzyme inhibition (protein-ligand docking) allows to investigate a ligand’s conformation inside the β5 active site of the proteasome thereby supporting proteasome inhibitor optimization. In this study inhibitors are considered that form a covalent bond to the β5 active site. Here modeling of the covalent interaction presented a major challenge. In collaboration with medicinal chemists of the lab of Prof. Schmidt (GrK 1657 – Project 2E) it was possible to establish a general procedure for the docking of covalently bound ligands using the software MOE. In an extended cooperation with crystallographers (Prof. Groll, TU München) and biochemists (Prof. Kloetzel, Charité Berlin) we have succeeded in developing potent and highly selective α-keto-phenylamide proteasome inhibitors. These are characterized through a unique binding mode to the primed sites of the substrate binding channel. In a follow-up project of this collaboration we focused on the elucidation of the natural proteolysis mechanism in the β5 subunit. It was hypothesized that substrates with large hydrophobic P1 residues interact with the Met45 side chain located in the β5 active site thus accelerating the cleavage mechanism. This trigger mechanism is considered to be analogous to that of a mouse trap. However, biochemical experiments have shown that the cleavage mechanism is also triggered by small residues which contradicts the hypothesis. Our results of extensive molecular dynamics (MD) simulations confirmed the Met45 side chain dynamics to be directly related to the substrate’s residue size. This shows that the β5 binding pocket accommodates to a variety of differently-sized substrate residues. These findings allow for future rational design of proteasome inhibitors. ow for future rational design of proteasome inhibitors. The DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) consisting of the protein Ku (with subunits Ku70 and Ku80) and its catalytic subunit (DNA-PKcs) is the key complex responsible for DNA double-strand break (DSB) repair at early stages of the non- homologous recombination pathway (NHEJ). For the development of DNA-PK inhibitors which modulate the NHEJ pathway, structural knowledge of the DNA-PK complex is mandatory. This work addresses the question if molecular coevolution can provide information on the yet unknown three-dimensional architecture of the iiiDNA-PK complex. Molecular coevolution defines the mutual evolution of interacting amino acid residues located at interaction interfaces in order to ensure residue recognition and complex stability. The mutual information (MI), an information-theoretical measure, was applied to coevolutionary signals in sets of homologous sequences. Different MI correction procedures were evaluated with respect to their ability to predict interacting residues in the Ku70/Ku80 complex of which the crystal structure is known. It turned out that prediction quality is limited. Results show that the procedures tested must be further enhanced to extract those signals revelant to protein-protein interactions from other background signals. In order to interfere with the homologous recombination pathway (HR), Rad54 is a straightforward target since this protein plays a substantial role in this DNA repair pathway. This project was developed in collaboration with radiation biologists of the lab of Prof. Löbrich (GrK 1657 - Project 1A) who discovered a specific phosphorylation reaction to be necessary for Rad54 activation. Using a reduced biophysical network model, putative phosphorylation-induced structural changes were investigated. Instead of the expected local response, dynamics intrinsic to the protein domain were observed. Most probably, these are related to the principal function of Rad54, namely the translocation along double-stranded DNA. This result led to a more intensive study on the structural basis of the translocation cycle which might be reproduced by currently available crystal structures. Based on these findings we were able to construct a three-dimensional model of the Rad54 structure from the zebrafish which serves as a starting structure for further studies.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Diese Arbeit hatte zum Ziel, die DNA-Schadensantwort in bestrahlten Tumorzellen auf molekularer Ebene zu erforschen. Mithilfe von verschiedenen computergestützten (in silico) Verfahren wurden strukturdynamische und evolutionäre Aspekte von drei strahlenbiologisch relevanten Proteinen bzw. Proteinkomplexen untersucht. Durch Inhibierung des 20S Proteasoms kann erreicht werden, dass Tumorzellen auf strahleninduzierte DNA-Schäden sensitiver reagieren als umliegendes, gesundes Gewebe. Proteasominhibitoren besitzen daher großes Potential als sogenannte radiosensitivierende Substanzen. Mithilfe einer computergestützten Simulation der Inhibition am Enzym (Protein-Ligand-Docking) kann die Konformation eines Liganden in der β5-Bindetasche des Proteasoms untersucht und die Wirkstoffoptimierung unterstützt werden. Eine Herausforderung stellte hier die Modellierung der kovalenten Bindung dar, welche zwischen den von uns betrachteten Inhibitoren und der β5-Bindetasche ausgebildet wird. In Zusammenarbeit mit Medizinalchemikern der Arbeitsgruppe von Prof. Schmidt (GrK 1657 – Projekt 2E) gelang es, ein universelles Verfahren für das Docking von kovalent gebundenen Inhibitoren in der Software MOE zu etablieren. In einer erweiterten Kooperation mit Kristallographen (Prof. Groll, TU München) und Biochemikern (Prof. Kloetzel, Charité Berlin) gelang die Entwicklung von potenten und hochselektiven Proteasominhibitoren aus der Substanzklasse der α-Keto-Phenylamide. Diese zeichnet sich durch eine einzigartige Ausnutzung der sogenannten primed sites des Substratbindekanals aus. Ein weiterführendes Projekt dieser Kooperation hatte die Charakterisierung des natürlichen Proteolyse-Mechanismus in der β5-Bindetasche zum Ziel. Es wurde die Hypothese postuliert, dass die Spaltungsreaktion ausschließlich durch lange, hydrophobe Reste des Substrats über Wechselwirkungen mit der Met45-Seitenkette der β5-Bindetasche ausgelöst wird, vergleichbar mit der Funktionsweise einer Mausefalle. Diese Hypothese wurde jedoch durch weitere experimentelle Ergebnisse, die zeigten, dass auch kurze Reste die Spaltungsreaktion auslösen können, widerlegt. Durch unsere umfangreichen Molekular-Dynamik-Simulationen konnte bestätigt werden, dass die Dynamik der Met45 Seitenkette direkt von der Länge des Substratrests abhängt. Dies zeigt, dass die β5-Bindetasche Reste verschiedener Länge aufnehmen kann, denen sie sich jeweils anpasst. Diese Erkenntnisse ermöglichen ein zukünftiges, genaueres Design von Proteasominhibitoren. Der DNA-abhängige Protein-Kinase-Komplex (DNA-PK), bestehend aus den Proteinen Ku (mit den Untereinheiten Ku70 und Ku80) und dem katalytisch aktiven DNA-PKcs, bildet das strukturelle Grundgerüst für die Reparatur von DNA- Doppelstrangbrüchen in der frühen Phase des Reparaturwegs der nicht-homologen Endverknüpfung (NHEJ). Für die Entwicklung von DNA-PK-Inhibitoren, die der NHEJ-Modulation dienen, ist strukturelles Wissen über den DNA-PK Komplex als solchen unabdingbar. Diese Arbeit beschäftigte sich daher mit der grundlegenden Fragestellung, ob molekulare Koevolution Aufschluss über den noch unbekannten dreidimensionalen Aufbau des DNA-PK-Komplexes geben kann. Molekulare Koevolution bezeichnet die wechselseitige Evolution von interagierenden Aminosäuren an der Oberfläche der am Komplex beteiligten Proteine, um die gegenseitige Erkennung und somit die Stabilität des Komplexes zu gewährleisten. Als ein informationstheoretisches Maß wurde die Mutual Information (MI) verwendet, um in homologen Sequenzdaten solche koevolutionären Signale zu detektieren. Verschiedene Korrekturverfahren der MI wurden bezüglich ihrer Vorhersagekraft von interagierenden Aminosäuren im Ku70/Ku80-Komplex, welcher aus der Kristallstruktur bereits bekannt ist, evaluiert. Es stellte sich heraus, dass die Vorhersage von Interaktionen nur beschränkt möglich ist. Die Ergebnisse zeigen, dass die verwendeten Verfahren weiter dahingehend optimiert werden müssen, die gewünschten Signale der Protein-Protein-Interaktion von dem Hintergrund weiterer Signale zu trennen. Die Modulation des Proteins Rad54 eröffnet die Möglichkeit, in die homologe Rekombination (HR) einzugreifen, da dem Protein in diesem DNA-Reparaturweg eine zentrale Schlüsselrolle zukommt. Dieses Projekt entstand innerhalb des Graduiertenkollegs in Kollaboration mit Strahlenbiologen der Arbeitsgruppe von Prof. Löbrich (GrK 1657 – Projekt 1A), welche zeigen konnten, dass eine bestimmte Phosphorylierungsreaktion notwendig ist, um Rad54 zu aktivieren. Mit einem reduzierten biophysikalischen Netzwerkmodell wurde untersucht, welche strukturellen Änderungen durch die Phoshorylierung induziert werden. Anstelle der erwarteten lokalen Antwort wurde eine intrinsische Dynamik der Proteindomänen beobachtet, die wahrscheinlich eng mit der hauptsächlichen Funktion von Rad54 verwandt ist: der Translokation entlang des DNA-Doppelstrangs. Dieses Resultat führte zu einer intensiveren Auseinandersetzung mit den strukturellen Grundlagen des Translokationszyklusses. Dieser konnte durch die aktuell verfügbaren Kristallstrukturen dargestellt werden. Auf Basis dieser Erkenntnisse wurde ein dreidimensionales Modell der Struktur des Rad54-Proteins aus dem Zebrafisch erstellt, welche nun als Ausgangsstruktur für weitere Studien dient.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 000 Allgemeines, Informatik, Informationswissenschaft > 004 Informatik
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Computational Biology and Simulation
10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 18 Sep 2015 11:30
Last Modified: 25 Sep 2015 12:25
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-42130
Referees: Hamacher, Prof. Dr. Kay and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 6 October 2014
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4213
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