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Influence of the extracellular matrix on cellular behaviour – Development and application of a bioengineered 3D cell culture system for cancer research and high resolution microscopy

Kämmerer, Elke :
Influence of the extracellular matrix on cellular behaviour – Development and application of a bioengineered 3D cell culture system for cancer research and high resolution microscopy.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2014)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Influence of the extracellular matrix on cellular behaviour – Development and application of a bioengineered 3D cell culture system for cancer research and high resolution microscopy
Language: English
Abstract:

The aim of this thesis was the application and establishment of a semi-synthetic, bioengineered model system for ovarian cancer and a naturally based, optimised hydrogel system for non-invasive high resolution microscopy analysis of plasma membrane dynamics in a physiological relevant microenvironment. Providing ex vivo models for cancer research with physiologically relevant 3D conditions combined with controllable physical and chemical composition is an ongoing challenge in the field of tissue engineering and cell biology. In this study a semi-synthetic GelMA-based hydrogel system was successfully applied to the study of ovarian cancer cells. Thereby GelMA provided a biomaterial approach combining natural binding and cleavage sites with tuneable properties in an easy to handle and cost-effective hydrogel system. Using this model system, the unique metastatic pattern of ovarian cancer, found in patients with late stage disease, was replicated in vitro and in vivo. The polymer concentration (2.5-7% w/v) did directly impact the hydrogel stiffness (0.5± 0.2 kPa – 8.9 kPa ± 1.8 kPa) but had only minor impact on solute diffusion. Diffusion of FITC labelled 70 kDa dextran was in all tested hydrogels (2.5-7% w/v; 29.9±3.3 till 16.9 μm2/s) close to the diffusion coefficient measured in water (39.2 ± 2.8 μm2/s). In the stiffest tested hydrogel the diffusion coefficient was decreased by only 2.3 times. Spheroid formation, occurring in the tumour fluid (ascites) of ovarian cancer patients with late stage disease, combined with the highest metabolic and proliferation rates was reflected in medium stiff hydrogels (5%, 3.4 kPa). Inhibition of hydrogel degradation, with a MMP inhibitor, reduced spheroid growth and metabolic activity. Additional ECM components, Laminin-411 and hyaluronic acid increased spheroid growth, metabolic and proliferation activity significantly. Furthermore this hydrogel system allowed bio-molecular analysis of mRNA and protein levels. Ovarian cancer cells showed an increased mRNA level of integrin β1 compared to monolayer or other 3D cultures. Next to the ex vivo experiments it was shown that GelMA-based hydrogels can be successfully used as spheroid-based cancer cell carrier system for in vivo studies. Spheroid-seeded hydrogels were intraperioteneally implanted into female NOD/SCID mice, resulting in tumour development and metastasis, known from the clinical sequence of the disease. The developed tumours showed a response rate of 33% to the anti-cancer drug paclitaxel, but not the integrin antagonist ATN-161. Combined treatment using both therapeutics resulted in 37.8% treatment response, while treatment with ATN-161 alone had no effect.Collagen-based hydrogel systems are widely used for investigations of cell-ECM crosstalk; however, they often lack reproducible, well characterised properties and are mostly not suitable for high resolution microscopy. A small volume collagen-based hydrogel system provided a 3D cell culture model utilised for high resolution microscopy approaches with optimised sample properties, such as sample immobilisation and minimised sample thickness. This study provided evidence of an alternative fluorescent labelling of collagen fibres after hydrogel polymerisation with E133 and Sirius Red. In particular E133 was a cost and timeeffective staining method, compatible with single photon CLSM and simultaneous cell-ECM imaging. Diffusion through collagen-based hydrogels was affected by surface properties of the diffusive particles rather than a size exclusive filtering. Carboxylated mircospheres (Ø 20 nm) did not diffuse through the hydrogel pores; they showed a high binding affinity towards collagen fibres. Also after 72 h, a gradient from the outer hydrogel parts to the centre was observable. This small volume collagen-based hydrogel system allowed culture of 4 different cell lines, showing high cell viability and being suitable for short and long term cultures. Compared to 2D cultures, adherent cell lines showed a different morphology in 3D, while non-adherent K562 cells did not show a morphological change. Studies on COS7 cells showed that next to morphology also cytoskeleton organisation was a function of the local microenvironment. In contrast, no differences in the intracellular organelle organisation between cells cultured in 2D or 3D was observed. Additionally this small volume collagenbased hydrogel system was suitable for single molecule microscopy measurements using the lipid like tracer molecule CellMask™Orange; a specific probe for plasma membrane labelling without biological function. This model system, combined with confined HILO excitation and a customised algorithm allowed single molecule microscopy also in a more complex, 3D microenvironment. Overall it was shown that mimicking a more natural, bioengineered microenvironment in a realistic experimental model can deepen the understanding of cancer cell behaviour and reaction to anti-cancer treatment. Moreover a 3D microenvironment does not exclude quantitative molecular assessment using single molecule microscopy, but therefore model system and analysis methods had to be adapted to this more complex situation.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Ziel dieser Arbeit war zum einen die Optimierung und Etablierung eines semi-synthetischen hydrogelbasierten 3D Zellkultursystems als experimentelles Modell für Eierstockkrebs und zum anderen die Optimierung eines natürlichen Hydrogelsystems für Untersuchungen der Membrandynamik an Zellen in einer möglichst natürlichen (3D) Umgebung. Die Entwicklung und Anwendung von Modellsystemen, die zellbiologische Untersuchungen in einer physiologischeren, 3D Umgebung ermöglichen, werden immer wichtiger, besonders in der Krebsforschung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass ein Gelatinemethacrylamidbasiertes (GelMA)-basiertes Hydrogelsystem erfolgreich als ex vivo und in vivo Modellsystem für Eierstockkrebs verwendet werden konnte. GelMA bietet dabei eine Kombination aus natürlichen Bindungs- und Degradierungsstellen mit einstellbaren physikalisch-chemischen Eigenschaften, beispielsweise Steifigkeit. GelMA-basierte Hydrogele wurden mit verschiedenen Polymerkonzentrationen (2.5%-7%) hergestellt, dabei stieg die Steifigkeit mit steigender Polymerkonzentration an (0.5± 0.2 kPa – 9.0 kPa ± 1.8 kPa). Überraschenderweise hatte die Polymerkonzentration dabei fast keinen Einfluss auf die Diffusionseigenschaften. Der Diffusionskoeffizient von FITC markiertem 70 kDA Dextran war bei allen Proben (2.5-7% w/v; 29.9±3.3 bis 16.9 μm2/s) in der gleichen Größenordnung wie der in Wasser (39.2 ± 2.8 μm2/s). Sphäroidbildung, wie sie in der Aszitesflüssigkeit bei Patientinnen mit Eierstockkrebs im fortgeschrittenen Stadium auftritt, zusammen mit einer hohen metabolischen Aktivität und Proliferationsrate wurde am besten in Hydrogelen mittlerer Steifigkeit (5%, 3.4 kPa) wiedergegeben. Eine Inhibierung der Hydrogel- Degradierung durch einen MMP-Inhibitor, reduzierte sowohl Sphäroidwachstum als auch Proliferation und die metabolische Aktivität. Das Einbringen zusätzlicher ECM-Komponenten, wie Laminin-411 und Hyaluronsäure resultierte des Weiteren in einem gesteigerten Sphäroidwachstum, einer höheren metabolischen Aktivität und einer angestiegenen Proliferationsrate. Für weitere molekularbiologische und biochemische Untersuchungen konnten erfolgreich mRNA und Proteinextrakt aus vorkultivierten GelMA-HA/-basierten Hydrogelen gewonnen werden. Dabei zeigte sich eine deutlich erhöhte integrin β1 Expression im Vergleich zu Zellen in 2D oder Zellen die in einem anderen 3D, PEG-basierten, Hydrogel kultiviert wurden. Neben den in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass vorkultivierte GelMA-Hydrogele, implantiert in weibliche NOD/SCID Mäuse, zur Tumorentwicklung führen und das gleiche Metastasierungsmuster zeigten, wie Patientinnen im fortgeschrittenen Krankheitsstadium. Eine Behandlung mit Paclitaxel resultierte in einem Ziel dieser Arbeit war zum einen die Optimierung und Etablierung eines semi-synthetischen hydrogelbasierten 3D Zellkultursystems als experimentelles Modell für Eierstockkrebs und zum anderen die Optimierung eines natürlichen Hydrogelsystems für Untersuchungen der Membrandynamik an Zellen in einer möglichst natürlichen (3D) Umgebung. Die Entwicklung und Anwendung von Modellsystemen, die zellbiologische Untersuchungen in einer physiologischeren, 3D Umgebung ermöglichen, werden immer wichtiger, besonders in der Krebsforschung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass ein Gelatinemethacrylamidbasiertes (GelMA)-basiertes Hydrogelsystem erfolgreich als ex vivo und in vivo Modellsystem für Eierstockkrebs verwendet werden konnte. GelMA bietet dabei eine Kombination aus natürlichen Bindungs- und Degradierungsstellen mit einstellbaren physikalisch-chemischen Eigenschaften, beispielsweise Steifigkeit. GelMA-basierte Hydrogele wurden mit verschiedenen Polymerkonzentrationen (2.5%-7%) hergestellt, dabei stieg die Steifigkeit mit steigender Polymerkonzentration an (0.5± 0.2 kPa – 9.0 kPa ± 1.8 kPa). Überraschenderweise hatte die Polymerkonzentration dabei fast keinen Einfluss auf die Diffusionseigenschaften. Der Diffusionskoeffizient von FITC markiertem 70 kDA Dextran war bei allen Proben (2.5-7% w/v; 29.9±3.3 bis 16.9 μm2/s) in der gleichen Größenordnung wie der in Wasser (39.2 ± 2.8 μm2/s). Sphäroidbildung, wie sie in der Aszitesflüssigkeit bei Patientinnen mit Eierstockkrebs im fortgeschrittenen Stadium auftritt, zusammen mit einer hohen metabolischen Aktivität und Proliferationsrate wurde am besten in Hydrogelen mittlerer Steifigkeit (5%, 3.4 kPa) wiedergegeben. Eine Inhibierung der Hydrogel- Degradierung durch einen MMP-Inhibitor, reduzierte sowohl Sphäroidwachstum als auch Proliferation und die metabolische Aktivität. Das Einbringen zusätzlicher ECM-Komponenten, wie Laminin-411 und Hyaluronsäure resultierte des Weiteren in einem gesteigerten Sphäroidwachstum, einer höheren metabolischen Aktivität und einer angestiegenen Proliferationsrate. Für weitere molekularbiologische und biochemische Untersuchungen konnten erfolgreich mRNA und Proteinextrakt aus vorkultivierten GelMA-HA/-basierten Hydrogelen gewonnen werden. Dabei zeigte sich eine deutlich erhöhte integrin β1 Expression im Vergleich zu Zellen in 2D oder Zellen die in einem anderen 3D, PEG-basierten, Hydrogel kultiviert wurden. Neben den in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass vorkultivierte GelMA-Hydrogele, implantiert in weibliche NOD/SCID Mäuse, zur Tumorentwicklung führen und das gleiche Metastasierungsmuster zeigten, wie Patientinnen im fortgeschrittenen Krankheitsstadium. Eine Behandlung mit Paclitaxel resultierte in einemZiel dieser Arbeit war zum einen die Optimierung und Etablierung eines semi-synthetischen hydrogelbasierten 3D Zellkultursystems als experimentelles Modell für Eierstockkrebs und zum anderen die Optimierung eines natürlichen Hydrogelsystems für Untersuchungen der Membrandynamik an Zellen in einer möglichst natürlichen (3D) Umgebung. Die Entwicklung und Anwendung von Modellsystemen, die zellbiologische Untersuchungen in einer physiologischeren, 3D Umgebung ermöglichen, werden immer wichtiger, besonders in der Krebsforschung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass ein Gelatinemethacrylamidbasiertes (GelMA)-basiertes Hydrogelsystem erfolgreich als ex vivo und in vivo Modellsystem für Eierstockkrebs verwendet werden konnte. GelMA bietet dabei eine Kombination aus natürlichen Bindungs- und Degradierungsstellen mit einstellbaren physikalisch-chemischen Eigenschaften, beispielsweise Steifigkeit. GelMA-basierte Hydrogele wurden mit verschiedenen Polymerkonzentrationen (2.5%-7%) hergestellt, dabei stieg die Steifigkeit mit steigender Polymerkonzentration an (0.5± 0.2 kPa – 9.0 kPa ± 1.8 kPa). Überraschenderweise hatte die Polymerkonzentration dabei fast keinen Einfluss auf die Diffusionseigenschaften. Der Diffusionskoeffizient von FITC markiertem 70 kDA Dextran war bei allen Proben (2.5-7% w/v; 29.9±3.3 bis 16.9 μm2/s) in der gleichen Größenordnung wie der in Wasser (39.2 ± 2.8 μm2/s). Sphäroidbildung, wie sie in der Aszitesflüssigkeit bei Patientinnen mit Eierstockkrebs im fortgeschrittenen Stadium auftritt, zusammen mit einer hohen metabolischen Aktivität und Proliferationsrate wurde am besten in Hydrogelen mittlerer Steifigkeit (5%, 3.4 kPa) wiedergegeben. Eine Inhibierung der Hydrogel- Degradierung durch einen MMP-Inhibitor, reduzierte sowohl Sphäroidwachstum als auch Proliferation und die metabolische Aktivität. Das Einbringen zusätzlicher ECM-Komponenten, wie Laminin-411 und Hyaluronsäure resultierte des Weiteren in einem gesteigerten Sphäroidwachstum, einer höheren metabolischen Aktivität und einer angestiegenen Proliferationsrate. Für weitere molekularbiologische und biochemische Untersuchungen konnten erfolgreich mRNA und Proteinextrakt aus vorkultivierten GelMA-HA/-basierten Hydrogelen gewonnen werden. Dabei zeigte sich eine deutlich erhöhte integrin β1 Expression im Vergleich zu Zellen in 2D oder Zellen die in einem anderen 3D, PEG-basierten, Hydrogel kultiviert wurden. Neben den in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass vorkultivierte GelMA-Hydrogele, implantiert in weibliche NOD/SCID Mäuse, zur Tumorentwicklung führen und das gleiche Metastasierungsmuster zeigten, wie Patientinnen im fortgeschrittenen Krankheitsstadium. Eine Behandlung mit Paclitaxel resultierte in einem Tumorrückgang von 33% und die Kombination mit dem Integrin Antagonist ATN-161 in einem Rückgang von 37.8%. Die Behandlung mit ATN-161 alleine zeigte keinen Effekt. Kollagenbasierte Hydrogele werden häufig für Untersuchungen von Zellinteraktionen mit der extrazellulären Matrix (ECM) eingesetzt, dabei sind die Hydrogeleigenschaften meist unvollständig charakterisiert, wenig reproduzierbar, und es gibt kaum Systeme die mit hochauflösenden Mikroskopiemethoden kompatibel sind. In dieser Arbeit wurde ein kleinvolumiges Hydrogelsystem etabliert, welches stabil an der Deckglasoberfläche anhaftete und so driftfreie Mikroskopie und reproduzierbare Eigenschaften ermöglichte. Um die Architektur dieser fibrillären Hydrogele genauer zu untersuchen, wurden alternative fluoreszierenden Farbstoffe, E133 und Sirus Red eingesetzt. Die Diffusionseigenschaften eines Hydrogels sind nicht nur abhängig von der Porengröße, vielmehr spielen Oberflächeneigenschaften eine wichtige Rolle. Es konnte gezeigt werden, dass carboxilierte micropsheres (Ø 20 nm) nicht ungehindert durch das kollagenbasierte Hydrogel diffundierten, sondern an Kollagenfasern binden und entlang dieser diffundieren. Diffusion durch Hydrogelporen wurde nicht beobachtet und auch nach 72 h war ein microspheres-Gradient vom äußeren Gelrand zur Gelmitte sichtbar. Das kleinvolumige kollagenbasierte Hydrogelsystem wurde erfolgreich für die Kultivierung von vier verschiedenen Zelllinien eingesetzt. Adhärente Zelllinien zeigten dabei eine unterschiedliche Morphologie und Organisation des Aktincytoskelets unter 2D und 3D Zellkulturbedingungen. Nicht-adhärente K562 Zellen zeigten keinerlei morphologische Unterschiede in 2D und 3D Kulturbedingungen. Unterschiede bezüglich der intrazellulären Organisation der Organellen in COS7-Zellen zwischen Zellen die unter 2D und 3D Bedingungen kultiviert wurden, wurden nicht beobachtet. Dieses kleinvolumige, kollagenbasierte Hydrogelsystem wurde dann für erste Einzelmolekülmessungen eingesetzt. Hierfür wurde Cellmask™Orange, ein lipophiler, plasmamembran-spezifischer Farbstoff, als Tracer-Molekül, eingesetzt um basale Parameter der Plasmamembranfluidität in Zellen in einer 3D Umgebung zu untersuchen. Mit Hilfe des optimierten Hydrogelsystems, selektiver Beleuchtung (HILO) und einem angepassten Tracking-Algorithmus waren erste Messungen von einzelnen Cellmask™Orange Molekülen in der Plasmamembran von lebenden Zellen in einer 3D Umgebung möglich. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass ein experimentelles Modell mit physiologischeren Eigenschaften das Wissen über Krebszellen, ihr Verhalten und Reaktion auf Therapeutika vertieft werden kann. Des Weiteren, wurde gezeigt, dass quantitative Analysen mittels Einzelmikroskopie auch in einer komplexeren, 3D Umgebung durchgeführt werden können, wenn Modellsystem und Analysemethoden aneinander angepasst werden.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Membrane Dynamics
Date Deposited: 08 Oct 2014 09:46
Last Modified: 09 Oct 2014 12:50
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-41816
Referees: Meckel , PD Dr. Tobias and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 5 September 2014
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4181
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