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Elucidation of DNA methylation changes in response to ionizing radiation induced double strand breaks

Herrlitz, Maren Linda :
Elucidation of DNA methylation changes in response to ionizing radiation induced double strand breaks.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2014)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Elucidation of DNA methylation changes in response to ionizing radiation induced double strand breaks
Language: English
Abstract:

Recent studies indicate that epigenetic modifications like DNA methylation are involved in the DNA damage response to ionizing radiation (IR). In this doctoral thesis DNA methylation changes after treatment with IR within one replication cycle time frame (≤ 24 hours) were investigated and a decrease in DNA methylation at short times after IR was observed. This fast decrease cannot be explained by a passive, replicationdependent mechanism due to reduced DNMT (DNA methyltransferase) expression. Rather it is conceivable that changing the enzymatic activity of enzymes may lead to changes in DNA methylation as a response to IR. In this context especially TET (ten eleven translocation) enzymes might play a role. These oxidize Methylcytosine (5mC) to Hydroxymethylcytosine (5hmC) and further to formylcytosine (5fC) and carboxylcytosine (5caC), being eventually replaced by cytosine via base excision repair (BER) mechanism. For the analysis of a TET-dependent DNA demethylation an appropriate experimental cellular system was established. Therefore, global 5mC levels, TET2 expression levels and 5hmC levels in different cell lines were investigated. An anti-correlation between 5mC levels and TET2 expression was shown for all cell lines, while 5hmC and 5mC levels were correlated only in a part of the investigated cell lines and no correlation between 5hmC and TET2 expression was observed. NIH/3T3 cells, showing no TET2 expression, were chosen for experiments in which the catalytic domain of TET2 (TET2CD-GFP) was overexpressed. Using two different techniques (immunofluorescence and ELISA-based colorimetric analysis), an increase in 5hmC abundance was demonstrated as a response to TET2CD-GFP overexpression, indicating that ectopically expressed TET2 is active. Similar results were obtained when TET2CD-GFP was overexpressed in U-2 OS cells, which have a high expression level of TET2. TET2CD-GFP overexpression also led to its accumulation in nucleoli. Whether this observation would be an effect of overexpression or be indicative of a possible function in these nuclear subcompartments is yet to be elucidated. Additionally, by using flow cytometry analysis, exposure to IR and concomitant overexpression of TET2CD-GFP strongly induced 5hmC formation, therefore suggesting a function of TET2 in response to irradiation. Recruitment analysis showed that the TET2 catalytic domain was recruited to UV laserinduced but not X-rays- or heavy ion-induced damage sites. Endogenous TET2, which was analyzed in high TET2 expressing human fibroblasts, was recruited to damage sites after irradiation with heavy ions or X-rays. As 5hmC is the direct product of the catalytic activity of TET enzymes, local 5hmC formation and abundance at damage sites was investigated. It was observed that 5hmC accumulated at heavy ion- as well as X-ray-induced DNA double strand breaks (DSBs). In addition, investigating 5hmC foci over time after irradiation with X-rays revealed that 5hmC formation and kinetics is similar to that of γH2AX foci, whereby every 5hmC focus co-localized with γH2AX. However, this did not hold true for all γH2AX foci, whose total number was always higher than that of 5hmC. Furthermore, 5hmC (and γH2AX) foci formation was almost unaffected by the inhibition of DNA-PKcs’ enzymatic activity. Conversely, 5hmC and γH2AX foci persistence was significantly delayed after DNA-PKcs inhibition. Results obtained in this thesis show that DNA methylation changes (5hmC formation) take place within the time frame of one replication cycle after exposure to IR and that these changes can be observed at sites of DSBs. 5hmC at DSBs might be formed by the oxidative function of TET2, which was shown to be recruited to DSBs. However, involvement of the other TET enzymes in 5hmC production cannot be excluded. Therefore, these results suggest a role of 5hmC in the response to IR induced DSBs, whereby the here presented data suggest that the fast, radiation induced demethylation of cytosine most likely is mainly catalyzed by TET2 besides other enzymes.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Aktuelle Studien weisen darauf hin, dass epigenetische Modifikationen, wie z.B. DNA Methylierung an der DNA-Schadensantwort nach Behandlung mit ionisierender Strahlung (IR) beteiligt sind. In dieser Doktorarbeit wurden Änderungen der DNA Methylierung nach Behandlung mit IR in einem zeitlichen Rahmen von einem Replikationszyklus (≤ 24 Stunden) untersucht und eine Abnahme der DNA Methylierung zu kurzen Zeiten nach IR beobachtet. Eine schnelle Abnahme lässt sich nicht durch einen passiven, replikationsabhängigen Mechanismus erklären, bei dem die Expression von DNA Methyltransferasen (DNMTs) inhibiert ist. Vielmehr ist es denkbar, dass die Änderung der enzymatischen Aktivität von Enzymen zu Änderungen der DNA Methylierung als Antwort auf IR beiträgt. Besonders TET (ten eleven translocation) Enzyme könnten hier eine Rolle spielen. Diese oxidieren Methylcytosin (5mC) zu Hydroxymethylcytosin (5hmC) und weiter zu Formyl- (5fC) und Carboxylcytosin (5caC), das durch Basenexzisionsreparatur (BER) durch Cytosin ersetzt werden kann. Zur Untersuchung einer TET-abhängigen DNA Demethylierung wurde zunächst ein geeignetes zelluläres Versuchssystem etabliert. Dazu wurden die globale 5mC und 5hmC Menge sowie die Expression von TET2 in verschiedenen Zelllinien bestimmt. Hierbei konnte eine Antikorrelation zwischen der 5mC Menge und der TET2 Expression gezeigt werden. Eine Korrelation zwischen 5hmC und 5mC Menge konnte nur für einen Teil der Zelllinien beobachtet werden, wobei 5hmC und TET2 Expression nicht korreliert waren. Da NIH/3T3 Zellen kein TET2 aufwiesen, wurden sie im Folgenden für Experimente gewählt, bei denen die katalytische Domäne von TET2 (TET2CD-GFP) überexprimiert wurde. Hierbei wurde mittels Immunfluoreszenz die 5hmC Menge in TET2CD-GFP transfizierten NIH/3T3 Zellen gemessen und ein Anstieg der 5hmC Menge nach TET2CD-GFP Überexpression beobachtet. Dies zeigte, dass ektopisch exprimiertes TET2 aktiv ist und 5hmC bilden kann; dies wurde durch die Verwendung einer ELISA-basierten kolorimetrischen Methode bestätigt. Die Expression von TET2CD-GFP in U-2 OS, einer Zelllinie die eine hohe, endogene TET2 Expression aufweist, zeigte zudem vergleichbare Ergebnisse. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass die Überexpression von TET2CD-GFP zu seiner Akkumulation in Nukleoli führt. Ob dies nur ein Effekt der Überexpression ist, oder auf eine Funktion innerhalb dieser nukleären Subkompartimente hinweist, muss noch geklärt werden. Ferner konnte durch Durchflusszytometrie gezeigt werden, dass die Expression von TET2CD-GFP zusammen mit Bestrahlung zu einer Zunahme der 5hmC Menge führt; dies deutet auf eine Funktion von TET2 nach Bestrahlung hin. Eine Rekrutierungsanalyse zeigte, dass die katalytische Domäne von TET2 zu UV-Laser induzierten Schäden rekrutiert wird, nicht aber zu Schäden, die durch Röntgenstrahlung oder durch Bestrahlung mit schweren Ionen induziert wurden. Endogenes TET2 in AG Zellen, mit ausgeprägter TET2 Expression, wurde allerdings zu DNA Doppelstrangbrüchen (DSBs), induziert durch Röntgenstrahlung oder nach Bestrahlung mit schweren Ionen, rekrutiert. Da 5hmC das direkte Produkt der enzymatischen Aktivität der TET Enzyme ist, wurde daraufhin untersucht ob auch 5hmC an Schäden akkumuliert. Ähnlich zu TET2 akkumulierte auch 5hmC an Schäden, die durch Bestrahlung mit schweren Ionen oder durch Röntgenstrahlung induziert wurden. Außerdem zeigte die Analyse eines zeitlichen Verlaufs von 5hmC Foci nach Röntgenbestrahlung, dass ihre Entstehung sowie ihr zeitlicher Verlauf dem von γH2AX Foci glichen. Hierbei kolokalisierte jeder 5hmC Fokus mit einem γH2AX Focus, wobei die Anzahl an γH2AX Foci immer höher war als die an 5hmC Foci. Es konnten also γH2AX Foci detektiert werden, die nicht mit 5hmC Foci kolokalisierten. Zusätzlich wurde festgestellt, dass die Entstehung von 5hmC (und γH2AX) Foci durch die Inhibition der enzymatischen Aktivität von DNA-PKcs nahezu unbeeinflusst blieb. Im Gegensatz dazu blieben 5hmC und γH2AX Foci nach DNA-PKcs Inhibition länger am Schaden sichtbar. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass innerhalb eines Replikationszykluses nach Bestrahlung mit IR Änderungen der DNA Methylierung (Bildung von 5hmC) erfolgen. Diese Veränderungen konnten an DSBs nachgewiesen werden. Da TET2 an DSBs rekrutiert wird, könnte 5hmC an DSBs durch die enzymatische Aktivität von TET2 entstehen. Allerdings kann eine Beteiligung anderer TET Enzyme, basierend auf diesen Beobachtungen, nicht ausgeschlossen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern daher erste Anhaltspunkte, die auf eine Rolle von 5hmC in der Antwort auf IR induzierte DSBs hinweisen. Die beobachtete, bestrahlungsabhängige, schnelle Cytosin Demethylierung wird dabei wohl hauptsächlich durch TET2 katalysiert; eine Beteiligung anderer Enzyme kann aber nicht ausgeschlossen werden.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 24 Jul 2014 10:47
Last Modified: 06 Aug 2014 12:00
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-40649
Referees: Durante, Prof. Dr. Marco and Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina
Refereed: 4 July 2014
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4064
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