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Entwicklung und Charakterisierung von zellulären B7 Vakzinen sowie Analyse und Manipulation ihrer Wechselwirkung mit T-Zellen

Kronfeld, Kai :
Entwicklung und Charakterisierung von zellulären B7 Vakzinen sowie Analyse und Manipulation ihrer Wechselwirkung mit T-Zellen.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2004)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Entwicklung und Charakterisierung von zellulären B7 Vakzinen sowie Analyse und Manipulation ihrer Wechselwirkung mit T-Zellen
Language: German
Abstract:

In dieser Arbeit konnte das Potential der T-Zell Aktivierung durch B7-1 bzw. B7-2 exprimie-rende Nierenkarzinomzellen gezeigt werden. Nach B7 vermittelter Costimulaton beginnen die T-Zellen zu proliferieren, produzieren Zytokine und entwickeln zytotoxische Aktivität. Parallel dazu wurde zum zur Einsatz dieser Zellen zur allogenen Vakzinierung von Patienten mit metastasierendem Nierenzellkarzinom eine SOP „Bestrahlung und Verabreichung des zellulären B7-Vakzins“ für eine klinische Pilotstudie etabliert. Eingehende in vitro Untersuchungen mit B7 exprimierenden Zellklonen zeigten, dass die T-Zell Aktivierung von der Menge der B7 Oberflächenmoleküle des zellulären Vakzins ab-hängt. Eine gesteigerte B7-Menge auf der Zelloberfläche führt zu einer gesteigerten T-Zell Antwort bis zu einem Optimum von 1,25 Mio B7 Molekülen pro Zelle. Eine Stimulation mit 2,4 Mio B7-2 Molekülen führt zu einer reduzierten T-Zell Aktivierung. Es wurden auch verschiedene Unterschiede zwischen der Stimulation mit B7-1 bzw. B7-2 und der Stimulierung HLA-gematchter bzw. ungematchter T-Zellen gefunden. Während die T-Zell Proliferation in allen Ansätzen ähnlich war, war die Sekretion von TNF? und IL-10 immer stärker bei Stimulation mit B7-2 exprimierenden Tumorzellen gegenüber B7-1 exprimierenden Zellen. Dieses unterschiedliche Aktivierungsmuster zeigte sich auch bei der IFN? und GM-CSF Sekretion HLA gematchter T-Zellen, nicht aber bei ungematchten T-Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein retrovirales Vektorsystem zur Expression von B7-1 und B7-2 etabliert, dass eine schnelle und effiziente Herstellung von autologen B7 Tumorvakzinen für zukünftige klinische Studien bietet. Durch eine hohe Transfektionseffizienz konnte auf den Einsatz immunogener Selektionsmarker verzichtet werden. Die so hergestell-ten Vakzine hatten in vitro gute T-Zell stimulierende Eigenschaften, wobei hier die T-Zell Aktivierung durch B7-1 Costimulation effizienter funktionierte. Durch die Klonierung eines Ribozyms für CTLA-4 konnte ein weiterer Weg für neue Therapieansätze eröffnet werden. Die Funktion des Ribozyms konnte in einem plasmidbasierten Systems gezeigt werden und für den klinischen Einsatz stehen retrovirale Expressionssysteme für das CTLA-4 Ribozym zur Verfügung. Die Expression der B7-homologen Moleküle wurde mit dem Schwerpunkt auf B7-H2 untersucht. Der Ligand des induzierbaren Costimulators ICOS ist ungeeignet zum Einsatz als zelluläres Vakzin, denn durch eine B7-H2 Überexpression in einer Nierenkarzinomzelllinie konnte kein siginifikante T-Zell Aktivierung erreicht werden. Der Ligand von PD-1, der negativ regulatorische Costimulator B7-H1, zeigte eine gute RNA Expression in allen Nierenkarzinomzelllinien nach Stimulation mit IFN?. Die B7-H1 Expression muss daher in vitro und in vivo beachtet werden. Zur Analyse der Proteinexpression von durch B7 Vakzinen aktivierten T-Zellen wurden Proteom- und Phosphoproteomanalysen durchgeführt. Dabei gelang die Identifizierung von 45 Proteinen, von denen nach weiterer Evaluierung Stathmin, PCNA, Neuropolypeptid h3 und das PDGF Bindeprotein ihre Eignung als Marker für eine erfolgreiche Aktivierung antigenspezifischer T-Zellen durch zelluläre B7 Vakzine zeigen konnten. Durch die Generierung von Proteinnetzwerken konnten elf der identifizierten Proteine in funktionellen Zusammenhang gebracht und essentielle Elemente für die B7 Costimulaton von T-Zellen aufgezeigt werden. Die Relevanz der neuen Einblicke in die B7 Costimulation und das Potential der aufgezeigten neuen therapeutische Ansätze dieser Arbeit werden sich in Zukunft zeigen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
In this work the potential for t-cell activation of B7-1 and B7-2 modified renal cancer cells, respectively, was shown. After B7 mediated costimulation the t-cells proliferate, produce cytokines and develop cytotoxic activity. In parallel for the use of these cells for allogeneic vaccination of patients with metastatic renal cell cancer (RCC) a SOP for radiation and administration of the cellular vaccine for a clinical pilot trial was established. Intensive in vitro analyses of B7 expressing cell clones showed, that the t-cell activation depends on the amount of B7 surface molecules of the cellular vaccine. Increasing B7 amount on the cell surface leads to an increased t-cell activation with an optimum at 1.25 Mio B7 molecules per cell. A stimulation with 2.4 Mio B7-2 molecules leads to a reduced t-cell acivation. It was although possible to detect differences in B7-1 and B7-2 stimulation potential of HLA-matched and mismatched t-cells, respectively. While t-cell proliferation was similar in all experiments, the secretion of TNF? and IL-10 was always stronger by stimulation with B7-2 expressing tumor cells compared with the use of B7-1 expressing cell clones. These differences in the activation pattern could although be observed by IFN? and GM-CSF secretion when HLA matched t-cells were stimulated. In the framework of this work retroviral B7-1 and B7-2 expression systems could be established. These systems allow an efficient production of autologous B7 tumor vaccines for clinical trials in the future. The very high transfection efficiency allows to disclaim an immunogenic selection marker. The produced vaccines showed good in vitro t-cell activation potenital. The cloning ao a CTLA-4 ribozyme could although show a new way for enhancing t-cell activation in the future. The expression of the B7-homologues molecules was analysed with focus on B7-H2. B7-H2 was expressed on all analysed cell lines and showed no t-cell activation potential when expressed on RCC cells. Expression of B7-H1 was inducible on RCC cells. Analyses of the proteome- and phosphoproteome patterns of t-cells activated with B7 tumor vaccines revealed several regulated proteins. The expression patterns of some of these proteins could be evaluated with RT-PCR or Western Blot analysis showing that these proteins could possibly in the future be used as biomarker for succesful cellular vaccinations in vivo.English
Uncontrolled Keywords: B7, B7-1, B7-2, tumor, vaccine, proteome, t-cell, B7-H2, B7-H1
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
B7, B7-1, B7-2, tumor, vaccine, proteome, t-cell, B7-H2, B7-H1English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:21
Last Modified: 07 Dec 2012 11:49
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000406
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-4069
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Nixdorff, Prof. Dr. Kathryn and Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Advisors: Seliger, Prof. Dr. Barbara
Refereed: 23 January 2004
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/406
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