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Die Rolle des Aquaporins CgPIP1;2 in der C4-Photosynthese von Cleome gynandra

Sperling, Henrik Tobias :
Die Rolle des Aquaporins CgPIP1;2 in der C4-Photosynthese von Cleome gynandra.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2014)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Die Rolle des Aquaporins CgPIP1;2 in der C4-Photosynthese von Cleome gynandra
Language: German
Abstract:

Cleome gynandra PIP1;2 (CgPIP1;2) ist ein Aquaporin unbekannter Funktion. Im Vergleich zu C. spinosa ist die Expression von PIP1;2 nach Quantifizierung einer Roche 454-Sequenzierung auf Transkriptebene in C. gynandra 20-fach erhöht. Beide Cleome unterscheiden sich weiterhin in ihrem Photosynthesetyp. Die Aquaporine CgPIP1;2 und CsPIP1;2 sind bei einem Vergleich der Aminosäuresequenz homolog zu Arabidopsis thalinana (AthPIP1;2) der eine Rolle in der C3-Photosynthese spielt. In der Arbeit sollte eine Bestätigung der Photosynthesetypen von C. gynandra und C. spinosa sowie die Bestätigung der unterschiedlichen Expression von PIP1;2 in beiden Pflanzenarten geführt werden. Die physiologischen Reaktionen von C. gynandra und C. spinosa auf unterschiedliche Lichtintensitäten sowie auf unterschiedliche CO2-Konzentrationen bestätigt die morphologische und biochemische Einordnung der Photosynthesetypen beider Pflanzen. Merkmale wie die relativ höhere Assimilationsrate von C. gynandra bei höheren Lichtintensitäten und konstanter, ambienter CO2-Konzentration (390 ppm), die relativ höhere Assimilationsrate von C. gynandra bei konstanter, hoher Lichtintensität und niedriger CO2-Konzentration (im Bereich von 70 und 375 ppm) ebenso wie der signifikant niedrigere CO2-Kompensationspunkt (CCP), sowie vergleichbare Assimilationsraten bei hoher CO2-Konzentration (750 ppm) von C. gynandra und C. spinosa sprechen für eine Einordnung von C. gynandra als C4-Pflanze und C. spinosa als C3-Pflanze. Es konnte bestätigt werden, dass die mRNA Level des Aquaporins CgPIP1;2 - verglichen mit CsPIP1;2 in 8~Wochen alten Pflanzen - 10-fache erhöht ist. Durch Funktionsanalyse von CgPIP1;2 und CsPIP1;2 im heterologen Expressionsmodell Hefe sollte die mögliche Funktion von PIP1;2 in der C4-Photosynthese untersucht werden. Funktionelle Tests im heterologen Expressionsmodell Hefe zeigten, im Vergleich zu NtPIP2;1, keine Funktionalität von CgPIP1;2 und CsPIP1;2 bezüglich einer Wasserleitfähigkeit der Aquaporine. Es konnte aber eine Funktionalität von CgPIP1;2 und CsPIP1;2 vergleichbar mit NtAQP1 gezeigt werden. Damit liegt eine Rolle der Cleome Aquaporine in der Photosynthese nahe. Die unterschiedlich starke Expression, sowie die Funktionalität der Aquaporine bezüglich CO2 legen damit eine Rolle von CgPIP1;2 in der C4-Photosynthese nahe. Die mögliche Lokalisation in der Plasmamembran von Pflanzenzellen von CgPIP1;2 lässt eine Rolle des Aquaporins bei der primären Fixierung des CO2 durch die Phosphoenolpyruvatcarboxylase (PEPC) als möglich erscheinen. Die Verringerung der CO2-Leitfähigkeit der Mesophyllzellen könnte einer optimalen primären Fixierung des CO2 dienen. Mittels eines viralen System (Virus induced Gene Silencing, "VIGS") kann man die gezielten Herabregulierung von spezifischen Transkripten erreichen und die Auswirkung auf die Pflanzen in weiteren Experimenten untersuchen. Durch die Anwendung bioinformatischer Methoden können "Next Generation Sequencing" (NGS) Daten analysiert und zur Lösung spezifischer Probleme genutzt werden. So kann aus Sequenzierungsdaten ein Transkriptom erstellt und Sequenzen von Interesse identifiziert werden. Auf diese Weise wurde die Sequenz der "Phytoene Desaturase" (PDS) aus Cleome ermittelt, um als Kontrolle für ein VIGS in Cleome zu dienen. Danach erfolgte eine Untersuchung der Verwendbarkeit des "Tobacco Rattle Virus" (TRV) für das VIGS in C. gynandra. Die Verwendbarkeit des TRV bei einem VIGS-Experiment mit C. gynandra ist durch das Fehlen einer Ausbreitung der Viren in diesen Pflanzen jedoch unwahrscheinlich.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Cleome gynandra PIP1;2 (CgPIP1;2) is an aquaporin of unknown function. Its expression on transcriptional level is 20-fold higher in comparison to Cleome spinosa PIP1;2 (CsPIP1;2) transcripts. Both Cleome differ in their type of photosynthesis and CgPIP1;2 and CsPIP1;2 are homologous to Arabidopsis thalinana (AthPIP1;2) which plays a role in the C3 photosynthesis. The Cleome types of photosynthesis and the different expression levels of the aquaporins had to be confirmed as a different expression might have an impact on the C4 photosynthesis. The physiological reactions of C. gynandra and C. spinosa to different light intensities and CO2 concentrations confirm the classification of the photosynthesis types by biochemical and histological means. Traits like the relatively higher rates of assimilation of CO2 shown by C. gynandra at higher light intensities and ambient CO2 concentrations (390 ppm), relatively higher assimilation rates at low CO2 concentrations (70 to 375 ppm) and constant light intensity, the significant lower CO2 compensation point (CCP) and the comparable assimilation rates at high CO2 concentrations (750 ppm) are indicators for the classification of C. gynandra as a plant with C4 photosynthesis and C. spinosa as a plant with C3 photosynthesis. It was confirmed that the expression of PIP1;2 in 8 week old C. gynandra and spinosa plants seems to be differentially expressed. Functional studies in the heterologous expression system yeast by stopped-flow spectroscopy showed a non-existent facilitation of water influx of CgPIP1;2 and CsPIP1;2 compared to NtPIP2;1, which is a well described water conducting aquaporin. The facillitation of CO2 through CgPIP1;2 and CsPIP1;2 in yeast is comparable with NtAQP1. This suggests a role of CgPIP1;2 and CsPIP1;2 in the photosynthesis of Cleome. Transfection of onion cells that led to the expression of a mGFP-tagged CgPIP1;2 showed a possible localization in the plasma membrane thereby hinting a possible role of the aquaporin in the primary fixation of CO2 by the phosphoenolpyruvat carboxylase (PEPC). The facilitation of CO2 diffusion at the plasma membrane could enable an optimal primary fixation of CO2 in the C4 photosynthesis. Knock-down of specific transcripts by Virus induced Gene Silencing (VIGS) can be used to generate plants for further analysis. "Next Generation Sequencing" (NGS) data of cleome was used to generate a transcriptome and isolate phytoene desaturase (PDS) sequences by bioinformatic means as a control for the VIGS. The usability of the Tobacco rattle virus (TRV) as an agent for the VIGS in cleome was tested. A propagation of an infection by the TRV in plant material of C. gynandra could not be shown. English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 580 Pflanzen (Botanik)
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 12 Jun 2014 13:02
Last Modified: 12 Jun 2014 13:02
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-40068
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Warzecha, Prof. Dr. Heribert
Refereed: 27 May 2014
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4006
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