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Ionotrope Glutamatrezeptoren als Targetstrukturen zur Modulation der Strahlenwirkung bei Glioblastomzellen

Längle, Adriana :
Ionotrope Glutamatrezeptoren als Targetstrukturen zur Modulation der Strahlenwirkung bei Glioblastomzellen.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2014)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Ionotrope Glutamatrezeptoren als Targetstrukturen zur Modulation der Strahlenwirkung bei Glioblastomzellen
Language: German
Abstract:

Glioblastoma Multiforme (GBM) ist einer der häufigsten und aggressivsten malignen Gehirntumore des Menschen und zeichnet sich durch eine hohe Strahlenresistenz und Invasivität aus. Verschiedene Zelllinien zeigen, dass Glioblastome den exzitatorischen Neurotransmitter Glutamat in Konzentrationen freisetzen, die ausreichen um die Zellproliferation, Infiltration und das Zellüberleben der Tumorzellen zu stimulieren. Zudem verursacht die erhöhte Glutamat Konzentration neuronalen Zelltod im peritumoralen Gewebe. Neben der physiologischen Rolle von Glutamat, die exzitatorische synaptische Transmission nach Bindung an postsynaptischen ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluRs) zu vermitteln, ist es zudem entscheidend für die Gehirnentwicklung und kognitive Funktionen, wie Lernen und Gedächtnisbildung. Unter diesen Bedingungen wird die Aktivierung von iGluRs zum Nukleus durch eine Ca2+-Signalkaskade übersetzt, welche zur Phosphorylierung des cAMP-responsive element binding Protein (CREB) führt. Dies fördert letztendlich das neuronale Überleben und die Plastizität. Seit die Expression von iGluRs in Tumorzellen nachgewiesen wurde, wird vermutet, dass die glutamaterge Signalübertragung in Glioblastomen an der Metastasierung und einer erhöhten Resistenz gegenüber einer Strahlen- und Chemotherapie beteiligt ist.

Dementsprechend war das Ziel dieser Arbeit die Wirkung von Glutamat und ionisierender Bestrahlung (IR) auf das Zellüberleben, die Migration und die DNA-Schadensantwort (DDR) in Glioblastomzellen zu untersuchen. Der Gedanke dahinter war die vermeintliche Interferenz der glutamatergen Signalübertragung und der DDR zu untersuchen, um Strategien zu entschlüsseln, die eine zielgerichtete Therapie für GBM ermöglichen. Der erste experimentelle Schritt bestand darin, die Expression von verschiedenen NMDA-, AMPA- und Kainat Rezeptoren der iGluR-Familie in unterschiedlichen GBM Zelllinien zu untersuchen. Die humanen Grad IV Glioblastomzellen (LN-229) zeigten eine robuste funktionelle Expression von NMDAR und AMPAR mithilfe von Patch Clamp Ableitungen. Bemerkenswerterweise wurde im Hinblick darauf eine unterschiedliche Expression der Glutamat-bindenden NMDAR NR2A und NR2B Untereinheiten im Soma und in Migrationsfortsätzen der Zellen mittels Immunzytochemie gefunden. Interessanterweise waren LN-229 Zellen in der Lage Glutamat in exzitotoxischen Konzentrationen in das extrazelluläre Medium freizusetzen. Deshalb wurde diese Zelllinie für weiterführende Versuche verwendet und mit Glutamat Konzentrationen von 10 mM, spezifischen Glutamatrezeptor Antagonisten und IR mit klinischen Dosen behandelt. Reparaturkinetiken strahleninduzierter DNA Doppelstrangbrüche (DSBs) wurden durch die Immunfluoreszenz des phosphorylierten Histon H2AX visualisiert und durch zählen von H2AX Foci quantifiziert. Die Untersuchung der Anzahl an H2AX Foci zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Bestrahlung offenbarte, dass die DDR in Anwesenheit von Glutamat signifikant verbessert wurde. Im Gegensatz dazu verschlechterten der NMDAR Kanalblocker MK-801, der Ca2+-Chelator Bapta-AM und der spezifische AMPAR Antagonist NBQX signifikant die Reparatur von DNA DSBs. Indessen zeigten Zellzyklusanalysen keinen Effekt auf den G2-Zellzykluskontrollpunkt, was darauf hindeutet, dass Glutamat einen spezifischen Effekt auf die DNA Reparatur hat. Im nächsten experimentellen Schritt wurde der Effekt von Glutamat und iGluR Antagonisten auf die Zellmigration untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass iGluR Antagonisten mit einem zerstörenden Effekt auf die DDR auch die Migration von LN-229 Zellen inhibieren, sogar nach Bestrahlung. Übereinstimmend mit der Expression der NR2B Untereinheit in Migrationsfortsätzen mittels Immunzytochemie konnte der NR2B-spezifische Antagonist Ifenprodil die Migration von LN-229 Glioblastomzellen selektiv inhibieren, was zusätzlich komplexe Effekte von Glutamat in LN-229 Zellen andeutet. Da die Wirkung von Glutamat auf iGluRs das neuronale Überleben und die Plastizität durch die Aktivierung des CREB Signalwegs stimuliert, wurde das Expressionslevel von pCREB in LN-229 Zellen analysiert. Western Blot Analysen und die Verwendung eines spezifischen Inhibitors des CREB Signalwegs weisen auf eine verstärkte DDR nach Aktivierung von CREB hin. Erwähnenswert ist die Phosphorylierung von CREB durch IR und Glutamat Behandlung, was CREB als Schlüsselfaktor bei der Glutamat-vermittelten DNA-Reparatur Effizienz erkennen lässt. Um das klinische Potential von iGluR Antagonisten zur Optimierung herkömmlicher Therapien zu verifizieren wurde letztendlich das Medikament Memantin getestet. Memantin ist ein schwach affiner NMDAR Antagonist und wird zur Behandlung von Alzheimer Patienten eingesetzt (in den USA unter dem Namen Namenda verkauft). Die Behandlung von LN-229 Zellen mit 50 µM Memantin äußerte sich in einer verminderten Überlebensfähigkeit und einer Sensibilisierung gegenüber Bestrahlung durch Blocken der NMDAR-vermittelten glutamatergen Signalübertragung. Die Daten weisen auf eine bedeutende Rolle des Neurotransmitters Glutamat für die Migration von Glioblastomzellen und die iGluR-aktivierte Effizienz der DDR nach IR hin und heben das klinische Potential von iGluR Antagonisten zur Optimierung einer Strahlentherapie bei GBM hervor.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most common and aggressive malignant primary brain tumors in humans characterized by a high radio-resistance and a high degree of invasive growth. Several lines of evidences indicate that glioblastomas secrete the excitatory neurotransmitter glutamate at concentrations sufficiently to stimulate proliferation, infiltration, and cell survival of the tumor cells. Furthermore, the increased glutamate concentrations in the vicinity of the tumor are assumed to cause excitotoxic neuronal cell death in the surrounding tissue. Beside the physiological role of glutamate to mediate excitatory neuronal transmission upon binding to postsynaptic ionotropic glutamate receptors (iGluRs), it is critically involved in brain development and cognitive functions like learning and memory formation. Under these conditions, activation of iGluRs is translated to the nucleus by a Ca2+-signaling cascade leading to phosphorylation of the cAMP-responsive element binding protein (CREB) promoting neuronal survival and plasticity. Since these iGluRs have been shown to be expressed in tumor cells, it is assumed that glutamatergic signaling in glioblastomas may be involved in promoting tumor survival, metastasis, and endowing tumors with an enhanced resistance to radiation- and chemotherapy. Thus, the aim of this work was to examine the impact of glutamate and ionizing radiation (IR) on cell survival, migration, and DNA damage response (DDR) in glioblastoma cells. The rationality behind it was to analyze a putative interference of glutamatergic signaling and DDR to unravel strategies facilitating targeted therapy for GBM. In an early stage of the experiments, the expression of different NMDA-, AMPA- and kainate-receptors of the iGluR-family were analyzed in several GBM cell lines. The human grade IV glioblastoma cells (LN-229) revealed robust functional expression of NMDAR and AMPAR upon patch clamp recording. Remarkably, a distinct expression of the glutamate-binding NMDAR NR2A and NR2B subunits was found in the soma and in migration-processes of the cells by immunocytochemistry, respectively. Interestingly, LN-229 cells were capable to secrete glutamate into the medium in excitotoxic concentrations. Thus, this cell line was used in the consecutive experiments and treated with glutamate at a concentration of 10 mM, specific glutamate receptor antagonists, and IR at clinical doses. Repair kinetics of induced DNA double-strand breaks (DSBs) were visualized by immunofluorescence of phosphorylated histone H2AX and quantified by counting H2AX foci. Analyzing the number of foci at different time points upon radiation revealed that DDR was significantly improved in the presence of glutamate. In contrast, the NMDAR channel blocker MK-801, the Ca2+-chelator Bapta-AM and the specific AMPAR antagonist NBQX significantly impaired the repair of DNA DSBs. However, cell cycle analyses revealed no effect on G2 cell cycle checkpoint, indicating a specific effect of glutamate on DNA repair capability. In a following set of experiments, the effect of glutamate and iGluR antagonists were examined on cell migration. The results show that iGluR antagonists disrupting DDR also inhibit cell migration of LN-229 cells, even after radiation. Consistent with the expression of the NR2B subunit found in migrating cell processes by immunocytochemistry, the NR2B-specific antagonist Ifenprodil selectively impaired migration of LN-229 glioblastoma cells, further indicating complex effects of glutamate in LN-229 cells. Since glutamate interacting with iGluRs stimulates neuronal survival and plasticity through activation of the CREB pathway, expression levels of pCREB were analyzed in LN-229 cells. Both western blot analyses and using specific inhibitors of CREB signaling pathways indicate enhanced DDR upon activation of CREB. Remarkably, CREB is phosphorylated by IR and upon glutamate treatment, indicating that CREB can be the key factor for glutamate-mediated DNA repair efficiency. However, to verify whether iGluR-antagonists have the clinical potential in optimizing conventional tumor therapies, the drug memantine was tested finally. Memantine is a low affinity antagonist of NMDARs and is used in the treatment of Alzheimer’s disease (sold in the USA as Namenda). Treatment of LN-229 cells with 50 µM memantine resulted in a decreased cell survival and a sensitization to IR by blocking NMDA receptor mediated glutamatergic signaling. Thus, the data presented shows a prominent role of the neurotransmitter glutamate for the migration of glioblastoma cells, the iGluR-mediated efficacy of DDR upon IR and highlight the clinical potential of iGluR-antagonists in optimizing radiation therapy in GBM treatment. English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
10 Department of Biology > Neurosensory Systems
Date Deposited: 27 Jun 2014 09:21
Last Modified: 27 Jun 2014 09:21
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-40045
Referees: Laube, Prof. Dr. Bodo and Thiel, Prof. Dr, Gerhard
Refereed: 26 May 2014
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4004
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