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Protein Engineering an Cystinknoten-Miniproteinen: Generierung von immunregulatorischen Varianten mit optimierten Bindungseigenschaften und Gerüststrukturen

Maaß, Franziska :
Protein Engineering an Cystinknoten-Miniproteinen: Generierung von immunregulatorischen Varianten mit optimierten Bindungseigenschaften und Gerüststrukturen.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2014)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Protein Engineering an Cystinknoten-Miniproteinen: Generierung von immunregulatorischen Varianten mit optimierten Bindungseigenschaften und Gerüststrukturen
Language: German
Abstract:

Das zytotoxische T-Lymphozyten Antigen 4 (CTLA-4) wird auf der Oberfläche von aktivierten T-Zellen exprimiert und ist maßgeblich an der Kontrolle der Immunaktivierung beteiligt. Durch die Inhibition oder Aktivierung von CTLA-4 können verschiedene Therapieansätze generiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wird die Isolierung und Charakterisierung von neuartigen Bindemolekülen des immunregulatorischen Rezeptors CTLA-4 beschrieben. Basierend auf dem Trypsin-Inhibitor MCoTI-II wurde hierfür eine kombinatorische Variantenbibliothek über Codon-basierte Synthese generiert. MCoTI-II gehört zur Familie der Cystinknoten-Miniproteine, die eine wichtige Molekülklasse in der diagnostischen und therapeutischen Anwendung sowie eine Schnittstelle zwischen Peptid- und Protein-basierten Medikamenten darstellen. Über die Selektion auf die Serinprotease Trypsin konnte die Funktionalität der Miniprotein-Bibliothek erfolgreich überprüft werden. Die darauffolgende Durchmusterung auf CTLA-4-Bindemoleküle erfolgte über fluorescence activated cell sorting (FACS) im yeast surface display (S. cerevisiae) und nach vier Sortierungsrunden wurden die isolierten Varianten analysiert. Ausgewählte Miniproteine wurden als Thioredoxin-Fusionsprotein in E. coli exprimiert und zeigten eine mikromolare Bindungskonstante. Eine MCoTI-II Variante wurde mittels Festphasensynthese (SPPS) chemisch synthetisiert, oxidativ gefaltet und anschließend biochemisch charakterisiert. Sie zeigte eine apparente Bindungsaffinität von etwa 3,7 µM und ihre Spezifität konnte mittels Immunfluoreszenzmarkierung an CTLA-4-überexprimierenden CHO-K1-Zellen sowie CTLA-4-präsentierenden EBY100-Zellen via Fluoreszenzmikroskop und FACS bestätigt werden. Eine Optimierung der Bindungsaffinität wurde durch die systematische Evaluation von Aviditätseffekten mit Oligomeren angegangen. Die Oligomerisierung des Miniproteins via Avidin zeigte eine spezifische Bindungsaffinität zwischen 20 nM (Bio-Layer Interferometrie) und 160 nM (ELISA). Außerdem erfolgte die rekombinante Fusion des CTLA-4-bindenden Miniproteins in 4-facher Kopienzahl an einen humanen Fc-Teil und führte im Vergleich zum Miniprotein-Monomer zu einer ca. 15-fach verbesserten Affinität.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) is expressed on the surface of activated T cells and plays a major role in the control of immune activation. By its inhibition or activation, different therapeutic approaches can be generated. This study describes the isolation and characterization of novel binding molecules of the immune regulatory receptor CTLA-4. Based on the structure of the trypsin inhibitor MCoTI-II, a combinatorial variant library was generated using codon-based synthesis. MCoTI-II is a member of the cystine knot miniprotein family, which represents an important class of molecules in diagnostic and therapeutic applications, as well as an interface between peptide- and protein-based drugs. By screening of the serine protease trypsin, the functionality of the variant library was successfully verified. The sorting of CTLA-4-binding miniproteins was performed using yeast surface display (S. cerevisiae) and fluorescence activated cell sorting (FACS). After four screening rounds, isolated variants were expressed as thioredoxin fusion proteins and showed a micromolare binding constant. One MCoTI-II variant was chemically synthesized via solid phase peptide synthesis (SPPS), oxidatively folded and subsequently characterized biochemically. The variant showed an apparent binding affinity of about 3.7 µM, and their specificity was confirmed by immunofluorescence labeling of CTLA-4-overexpressing CHO-K1 cells and CTLA-4-presenting yeast cells via fluorescence microscopy and FACS. Optimization of binding affinity was addressed by the systematic evaluation of avidity effects with oligomers. The oligomerization of the CTLA-4-binding miniprotein via avidin showed a specific binding affinity of 20 nM (bio-layer interferometry) and 160 nm (ELISA). In comparison to the monomeric miniprotein an approximately 15-fold improved affinity resulted from a tetramer that was generated by recombinant fusion of the miniprotein on a human Fc-part.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 09 May 2014 07:21
Last Modified: 09 May 2014 07:21
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-39267
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Neumann, Prof. Dr. Siegfried and Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Schmitz, Prof. Dr. Katja
Refereed: 29 April 2014
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3926
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