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Development and monitoring of a novel monoclonal antibody purification strategy

Capito, Florian :
Development and monitoring of a novel monoclonal antibody purification strategy.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2014)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Development and monitoring of a novel monoclonal antibody purification strategy
Language: English
Abstract:

The studies presented in the cumulative part of this thesis illustrate the different steps to develop a polymer-driven antibody purification process. These peer-reviewed reports show in detail fundamental research, additional method development useful in the development of such a purification process as well as implementation of the final process. A strategy for analyzing copolymers, synthesized by a lab in house, was implemented with particular emphasis on copolymer composition analysis. This was especially important in the context of understanding how copolymer composition affects precipitation yield and selectivity. Compared to 1H-NMR composition analysis, the use of ATR infrared spectro-scopy enabled a cost-effective and fast analysis of copolymers and according adjustment of synthesis parameters.Besides the benefits for this project, the similar analytical power of IR compared to NMR was shown, also allowing small-scale companies to use such a technique. Following synthesis and synthesis optimization, basic research experiments were conducted, elucidating how ionic strength, polymer chain length, polymer chain flexibility, pH, pyhsico-chemical properties of copolymer and protein as well as copolymer composition affect precipitation behavior. Similar to relevant work in the literature, cited in the introduction section, increasing ionic strength led to reduced precipitation yields. Additionally to these known aspects, low ionic strength also resulted in reduced precipitation yield.We concluded polyelectrolyte chain conformation being rather stiff at low ionic strength to be the reason for these findings. At low ionic strength, charges at polyelectrolyte sub-units are not sufficiently shielded anymore, leading to a more expanded conformation of the polyelectrolyte. This would then impede interaction with the proteins. Comparing precipitation behavior of different anti-bodies, the required polyelectrolyte flexibility to allow for high precipitation yields depended on the charge density of the protein.[56] These new insights could also help in the design of polyelectrolytes with defined flexibility to control precipitation selectivity. Another important factor is polymer chain length, which does not only influence yield and selectivity. It also affects precipitation efficiency, meaning the number of polymer chains required to obtain precipitation of an antibody molecule.The use of polymer standards with defined molecular weight distribution revealed that the polymer chain length required per precipitated protein molecule is up to 25-times larger than the actual diameter of the specific protein. Moreover, comparing different types of polymers within this context, the defined length of polymer chain length differed among these copolymers. Under precipitation conditions strongly charged polymers allowed precipitation even with short defined lengths, meaning they enabled efficient precipitation. Moreover, a further adjustment of selectivity and yield can be achieved altering the copolymer composition. Compared to results by other working groups, cited in the introduction section, the use of these copolymers allowed higher salt tolerance and higher yields without prior dilution of the cell culture fluid. Simultaneously, infrared spectroscopy was used as a process-assessment tool, determining the amount of antibody, host cell proteins as well as aggregated antibody before and after precipitation to analyze selectivity and yield.This was particularly important, as e.g. the use of ELISA-assays for HCP quantification is quite costly, especially during process development which requires a large number of these assays to be used. Regarding aggregation analysis and quantification, IR has already been used in the past, as shown by literature cited in the introduction section and was further advanced not only to provide information about the presence of aggregation but also to quantify the amount of aggregates in a sample. The results of these peer-reviewed reports were suitable in the context of this thesis and precipitation process development. Additionally as the here developed quantification procedures for antibody titer, aggregate level and host cell protein amount may also find suitable application as a general fast and cost-effective process-monitoring technique, they are currently under consideration for a patent application. Some further experiments were conducted showing that infrared spectroscopy can be used to distinguish antibodies from other proteins based on differences in secondary structure. These findings were, together with additional denaturation monitoring experiments, submitted for a book chapter. Moreover, they allowed comparison of the secondary structure of monoclonal antibodies before and after precipitation, to elucidate any changes to the protein secondary structure and thus harmful effects of this process.Integration of all these findings helped to implement a protein purification process based on precipitation. This process was then compared to protein A chromatography with respect to costs and effectiveness.The developed process can be used within the purification cascade and may replace at least in part existing initial chromatography-based purification processes. Compared to protein A affinity chromatography, costs are lower for future high titer cell culture systems used for antibody production.Yet, additional applications beyond antibody production are also feasible.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Therapeutische Antikörper finden eine breite Anwendung in klinischen Applikationen, Diagnostik sowie Forschung und Entwicklung. Diese Proteine werden u.a. in Säugetierzellen in Bioreaktoren produziert und müssen danach über Aufreinigungskaskaden im sogennanten „Downstream processing“ von anderen, unerwünschten Proteinen sowie Verunreinigungen getrennt werden. Typischerweise erfolgt zunächst eine Klärifizierung des Zellkulturüberstandes durch Zentrifugation und Filtration und danach eine Reihe von chromatographischen Schritten sowie weitere Filtrationen. Der initiale Chromatographieschritt ist hierbei üblicherweise eine Affinitätschromatographie, basierend z.B. auf Protein A oder G. Das Zielprotein bindet dabei an die Säulenmatrix, wobei unerwünschte Störproteine, sogenannte „host cell proteins“, abgetrennt werden können. Dieser Schritt beinhaltet eine Elution des gebundenen Zielproteins durch pH-Erniedrigung und kann mit einem Virusinaktivierungsschritt verknüpft werden. Danach folgen typischerweise Ionenaustauschchromatographie, z.B. Kationenaustauschchromatographie zur Abreicherung von Antikörperaggregaten, sowie hydrophobe Interaktionschromatographie. Nach einer finalen Filtration und zusätzlichen Virusinaktivierung kann das gereinigte Protein als „Drug Substance“ Verwendung finden. Bei diesem Herstellungsprozess wurden in den letzten Jahrzehnten erhebliche Fortschritte erzielt, was zu Steigerungen bei der Ausbeute geführt hat. Die höheren Volumenausbeuten haben jedoch gleichzeitig zu einer Verlagerung des Engpasses bei der Produktion weg vom Upstream, hin zum Downstream Bereich geführt. Dieser Engpass findet sich also nun in der Aufreinigung. Herkömmliche Chromatographie-basierte Systeme stoßen hierbei an ihre Kapazitätsgrenzen. Zusätzlich kann z.B. der Elutionsschritt bei der Affinitätschromatographie in der Aufreinigungskaskade unerwünschte Aggregate erzeugen. Diese Aspekte sowie steigender wirtschaftlicher Druck auf die Hersteller verlangen die Entwicklung alternativer nicht Chromatographie-basierter Aufreinigungsverfahren, um diesen Problemen - zumindest teilweise- entgegenzuwirken. Möglichkeiten hierfür sind z.B. größere Chromatographiesäulen, eine größere Kapazität der Säulenmaterialien, Wegwerfsäulen oder gezielte Fällung der Proteine in Batch-Verfahren. Beispiele für diese Fällung sind die Fällung von Immunglobulinen mit Caprylsäure, das Aussalzen mittels Ammoniumsulfat sowie die Fällung mit Polyethylenglykol (PEG). Die Verwendung dieser Fällungsmittel hat jedoch einige Nachteile. Einige dieser Präzipitantien müssen in größeren Konzentrationen eingesetzt werden und führen dadurch zu größeren Abfallmengen, andere erfordern bestimmte Mindestkonzentrationen der zu fällenden Proteine. Daher sind Polyelektrolyte als Kopolymere in den wissenschaftlichen Fokus gelangt. Diese erlauben eine gerichtete Anpassung an die biophysikalischen Eigenschaften des Zielproteins, indem neben dissoziierbaren Gruppen (Eigenschaft der Polyelektrolyte) auch Gruppen mit ausgeprägten hydrophoben bzw. hydrophilen Eigenschaften ins Kopolymer eingefügt werden. Diese „mixed-mode“ Eigenschaften ermöglichen eine selektivere Präzipitation des Zielproteins, als dies durch Polymere mit rein elektrostatischen bzw. rein hydrophoben Wechselwirkungen möglich wäre (siehe Journalbeiträge [4] und [6]). Die Verwendung dieser Kopolymere soll u.a. dazu dienen, den initialen Affinitätschromatographieschritt zu ersetzen. Durch direkte Zugabe der Kopolymere in die klärifizierte Fermentationsbrühe kann in einem Batch-Verfahren eine selektive bzw. semi-selektive Fällung des Zielproteins erreicht werden. Nach Präzipitation und Rücklösung des Zielproteins in einem definierten Volumen kann zusätzlich eine Aufkonzentrierung erzielt werden und weitere folgende Chromatographieschritte teilweise ersetzt bzw. deren Kapazität erhöht werden. Dies kann idealerweise Aufreinigungsdauer und Aufwand verringern und gleichzeitig Ausbeute, Lebensdauer von Säulenmaterialien sowie Reinheit des Zielproteins erhöhen. Dafür müssen solche Kopolymere jedoch speziellen Anforderungen genügen wie: (a) geringe Herstellungskosten; (b) hohe Selektivität und Ausbeute bei der Fällung; (c) einfache Anpassung an jeweilige Zielproteine; (d) gute Rückgewinnung bzw. Abtrennung vom Präzipitat; (e) sinnvollerweise geringere oder vergleichbare Kosten im Bezug zu etablierten Aufreinigungs-verfahren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Kopolymere neu synthetisiert und für die spezifischen Anforderungen der Proteinaufreinigung untersucht. Durch systematische Variation der Kopolymerzusammensetzung gelang es, einen optimierten Präzipitationsprozess zu etablieren, welcher auch als Patentanmeldung eingereicht wurde. Die mit diesem Prozess assoziierten Kosten wurden hierbei mit Protein A Affinitätschromatographie verglichen und zeigten die Wirtschaft-lichkeit der Präzipitation gegenüber Chromatographie ab einem bestimmten Antikörpertiter in der Produktion (Journalbeitrag [4]). Parallel zur Entwicklung eines Kopolymer-basierten Protein-aufreinigungsverfahrens wurden grundlegende Mechanismen der Kopolymer- Protein- Interaktion untersucht, auch um die Selektivität und Ausbeute zu verbessern und ein tiefergehendes Verständnis der Präzipitation zu schaffen (Journalbeiträge [3] und [7]). Die Abhängigkeit der Präzipitation von physiko-chemischen Eigenschaften der zu fällenden Proteine an Hand eines eingeführten binären Proteintestsystems war Gegenstand weiterer Untersuchungen (Journalbeitrag [6]). Als analytische Methode zur Untersuchung des Präzipitationsprozesses wurde die Infrarotspektroskopie eingesetzt [Journalbeiträge [1], [2], [4], [5], [7], Buchkapitel [8]). Sie erlaubte nicht nur eine Aussage über die Zusammensetzung der verwendeten Kopolymere sondern auch über die Präzipitationsausbeute und Selektivität der Fällung. Dabei wurden in einem at-line Verfahren der Titer des zu präzipitierenden Antikörpers, die Bildung von Aggregaten sowie der Gehalt an unerwünschten „host cell proteins“ bestimmt. Zusätzlich zur Nutzung der IR im speziellen Rahmen der Präzipitationsprozessentwicklung konnte gezeigt werden, dass diese Technik auch im Allgemeinen für die Quantifizierung kritischer Prozessparameter bei der Proteinaufreinigung Nutzung finden kann. Diese kritischen Prozessparameter beinhalten neben den oben genannten Parametern z.B. auch Endotoxine und exakte Konzentration an Antikörperaggregaten. Spezielle Anwendungsbeispiele dazu wurden in Publikationen und einer Patentanmeldung beschrieben (Journalbeiträge [1], [2] und [5]). German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 11 Feb 2014 11:08
Last Modified: 11 Feb 2014 11:08
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-37691
Referees: Kolmar, Dr. Harald and Schmitz, Dr. Katja
Refereed: 20 January 2014
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3769
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