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Interaktionen und Aggregationsverhalten von akzessorischen Gasvesikelproteinen bei der Gasvesikelbildung in Haloarchaea

Tavlaridou, Stella :
Interaktionen und Aggregationsverhalten von akzessorischen Gasvesikelproteinen bei der Gasvesikelbildung in Haloarchaea.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2014)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Interaktionen und Aggregationsverhalten von akzessorischen Gasvesikelproteinen bei der Gasvesikelbildung in Haloarchaea
Language: German
Abstract:

Die Gasvesikelbildung in Hbt. salinarum PHH1 wird durch die Expression der p-vac Region vermittelt. Sie besteht aus zwei entgegengesetzt orientierten Genclustern gvpACNO und gvpDEFGHIJKLM. Als Strukturproteine der Gasvesikel wurden GvpA und GvpC identifiziert. GvpA bildet über Multimerisierung die gaspermeable Hülle, die von GvpC an der Außenseite stabilisiert wird. GvpA, F, G, J, K, L, M und O sind für die Bildung von Gasvesikeln essentiell. Die Gene gvpFGHIJKLM werden in der frühen, exponentiellen Wachstumsphase und vor dem Sichtbarwerden von bikonischen Proteinaggregaten, den Vorläuferstrukturen der Gasvesikel, transkribiert. Daher geht man davon aus, dass die entsprechenden Genprodukte bei der Initation der Gasvesikelbildung eine Rolle spielen. Die genaue Funktion dieser sogenannten akzessorischen Gasvesikelproteine ist jedoch noch unklar. In dieser Arbeit wurde die Rolle der akzessorischen Gasvesikelproteine GvpF, G, H, I, J, K, L und M bei der Gasvesikelbildung in Hbt. salinarum PHH1 untersucht. Dabei lag der Schwerpunkt auf der Analyse der Protein-Protein-Interaktionen und des Aggregations-verhaltens der Gasvesikelproteine. Zunächst wurde der Effekt einer Überproduktion eines einzelnen Gasvesikelproteins in p-vac-Transformanten analysiert. Zur Überproduktion wurde dabei der Expressionsvektor pJAS35 verwendet, der den inserierten gvp-Leserahmen unter Kontrolle des starken Ferredoxin-Promotors exprimiert. Die Überproduktion von GvpG, H oder M führte zu einer Inhibition der Gasvesikelbildung, während erhöhte Mengen von GvpF, I, J, K oder L keinen Effekt hatten. Eine mögliche Erklärung für die reduzierte Gasvesikelbildung in p-vac +pGex-, +pHex- oder +pMex-Transformanten ist, dass die großen Mengen von GvpG, H oder M mit anderen, nur in geringer Menge vorhandenen, essentiellen Gasvesikelproteinen interagieren und diese dann nicht mehr für die Gasvesikelbildung zur Verfügung stehen. Die Überproduktion von mehreren akzessorischen Gasvesikelproteinen stört die Gasvesikelsynthese dagegen nicht, wie der Vac positive Phänotyp von p-vac +pGHIJKLMex-Transformanten zeigte. Offenbar muss die relative Menge bestimmter, akzessorischer Gasvesikelproteine zueinander in einem bestimmten Verhältnis stehen, um eine intakte Gasvesikelbildung zu gewährleisten. Am Beispiel von GvpM wurde getestet, ob die gleichzeitige Produktion ähnlich großer Mengen eines weiteren einzelnen Gasvesikelproteins in der Lage ist, die inhibitorische Wirkung von GvpM zu kompensieren. Hierfür wurden p-vac +pGMex-, +pHMex-, +pJMex- und +pLMex-Transformanten hergestellt und bezüglich der Bildung von Gasvesikeln untersucht. Die inhibitorische Wirkung großer Mengen von GvpM auf die Gasvesikelbildung kann durch vergleichbar große Mengen von GvpH, GvpJ oder GvpL neutralisiert werden, jedoch nicht durch vergleichbar große Mengen von GvpG. Eine intakte Gasvesikelbildung setzt also ein balanciertes Mengenverhältnis von GvpM zu GvpH, GvpJ oder GvpL voraus. Die Western-Analysen mit pHMex und pJMex zeigten bei Verwendung eines Antiserums gegen GvpH bzw. GvpJ neben dem Protein-Monomer zusätzlich größere Proteinbanden. Dies lässt eine Multimerisierung in Gegenwart von GvpM bzw. eine Interaktion mit GvpM vermuten. Mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie konnte eine Interaktion zwischen GvpHHis und GvpM, GvpLHis und GvpM sowie GvpMHis und GvpJ in vitro mit in Hochsalz rückgefalteten GvpHis-Proteinen nachgewiesen werden, nicht jedoch zwischen GvpMHis und GvpG. In dieser Arbeit wurden auch die Aggregationen von Gasvesikelproteinen in vivo durch Fusion mit einer speziell an Hochsalzbedingungen adaptierten GFP-Variante detektiert. Bei GvpMGFP wurden fluoreszierende Punkte in der Zelle beobachtet, was die starke Aggregation von GvpM unterstreicht. Bei GvpHGFP zeigte sich, dass dieses normalerweise lösliche Protein in Gegenwart der p-vac-Proteine in Aggregaten vorliegt. Für GvpM-GvpH und GvpM-GvpL konnte die Interaktion dieser Proteinpaare mit den entsprechenden GFP-Varianten direkt in vivo nachgewiesen werden. Die Interaktion von GvpM und GvpH führt offenbar dazu, dass GvpMGFP keine detektierbaren Aggregate mehr bildet. In Gegenwart von GvpL sind weiterhin GvpM-Aggregate vorhanden und GvpL ist in diese Aggregate integriert. Möglich wäre, dass diese Interaktionen zur Bildung eines Initiationskomplexes führen, der zur Gasvesikelbildung benötigt wird. Sowohl GvpH als auch GvpL kompensieren, vermutlich durch Interaktion mit GvpM, die inhibitorische Wirkung großer Mengen von GvpM auf die Gasvesikelbildung, jedoch durch unterschiedliche Mechanismen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurden GvpM-Mutanten und ihr Einfluss auf die Gasvesikelbildung untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass vor allem hydrophobe Aminosäuren im N-terminalen und mittleren Bereich des Proteins für dessen Funktion essentiell sind. Da keine der Mutationen die Morphologie der Gasvesikel veränderte, ist GvpM wahrscheinlich nicht an der Formgebung der Gasvesikel beteiligt, sondern spielt bei der Initation der Gasvesikelbildung eine wichtige Rolle.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Gas vesicle formation in haloarchaea requires the expression of the p-vac region consisting of 14 genes, gvpACNO and gvpDEFGHIJKLM. GvpA and GvpC are the two major structural proteins. GvpA forms the gas-permeable wall by aggregation and GvpC strengthens the gas vesicle wall by attaching to the exterior surface. GvpA, F, G, J, K, L, M and O are all essential for gas vesicle formation.The gvpFGHIJKLM genes are expressed in the early exponential growth phase before the appearance of gas vesicles. So the products of these genes could be involved in the initation of gas vesicle formation, but their real function is not yet clear. In this study the role of the accessory proteins GvpF, G, H, I, J, K, L and M during gas vesicle formation of Halobacterium salinarum PHH1 was analysed. An overexpression of gvpG, gvpH or gvpM in addition to p-vac inhibited gas vesicle formation, whereas large amounts of all other Gvp proteins did not disturb the synthesis. Potentially large amounts of these proteins interact with other essential gas vesicle proteins what makes them unavailable for further gas vesicle formation. In contrast the overexpression of the gvpGHIJKLM genes did not disturb the gas vesicle formation in p-vac transformants. As a consequence the relative amounts of certain accessory proteins have to be balanced for an intact formation of gas vesicles. In search for proteins neutralizing the inhibitory effect in case of GvpM, p-vac +pGMex, +pHMex, +pJMex and +pLMex transformants were constructed. The inhibitory effect of GvpM on gas vesicle formation was supressed by GvpH, GvpJ and GvpL, but not by GvpG. A balanced amount of GvpM to GvpH, J or L appears to be important during gas vesicle formation. Western analysis demonstrated that pHMex and pJMex transformants contained additional larger protein bands when probed with an antiserum raised against GvpH or GvpJ, implying a multimerisation in the presence of GvpM or an interaction with GvpM. An interaction between GvpHHis and GvpM, GvpLHis and GvpM and GvpMHis and GvpJ could be shown by affinity chromatography in vitro with GvpHis proteins refolded in high salt buffers. Such an interaction was not shown between GvpMHis and GvpG. Furthermore the aggregation of gas vesicle proteins was analysed in vivo using Gvp fusions with a salt adapted version of the green fluorescent protein (GFP). Fluorescent dots of GvpM-GFP were seen in cells in vivo underlining a strong aggregation of GvpM. For GvpH-GFP it could be shown that this soluble protein forms aggregates in the presence of other p-vac proteins. Interactions between GvpM-GvpH and GvpM-GvpL could be detected in vivo with the respective GFP transformants. GvpMGFP does not form aggregates when interacting with GvpH. In the presence of GvpL, GvpMGFP forms aggregates and GvpL is integrated in these aggregates. It is possible that these interactions lead to the formation of a gas vesicle initiation complex. Both GvpH and GvpL compensate the inhibitory effect of large amounts of GvpM, probably by interaction with GvpM. By analysing mutants of GvpM and their influence on gas vesicle formation, it could be shown that mainly hydrophobic amino acids are essential for the protein function. Because none of the mutations changed the morphology of the gas vesicles, GvpM probably does not influence the shape of the gas vesicles, but plays an important role in the initation of gas vesicle formation. English
Place of Publication: Darmstadt
Uncontrolled Keywords: halophile Archaea, Gasvesikelbildung,Gasvesikelprotein, Interaktion, salz-adaptiertes GFP
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
halophilic Archaea, gas vesicle formation, gas vesicle protein, interaction, salt-adapted GFPEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Microbiology and Archaea
Date Deposited: 23 Jan 2014 08:48
Last Modified: 23 Jan 2014 08:48
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-37579
Referees: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas and Kletzin, PD Dr. Arnulf
Refereed: 17 December 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3757
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