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Synthetische RNA-Schalter zur Regulation zellulärer Prozesse

Langner, Janina :
Synthetische RNA-Schalter zur Regulation zellulärer Prozesse.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2013)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Synthetische RNA-Schalter zur Regulation zellulärer Prozesse
Language: German
Abstract:

Ziel dieser Arbeit war es, Strategien zur Etablierung synthetischer, RNA basierter Genschalter zu entwickeln. In einem Teilprojekt sollte die virale Replikation des RNA-Virus Semliki Forest Virus (SFV) mit einem RNA-Schalter reguliert werden. Hierzu wurde das Tetrazyklin bindende Aptamer in den subgenomischen Promotor inseriert, um bei Ligandbindung mit der Promotorerkennung zu interferieren. In einem weiteren Ansatz wurde das Theophyllin abhängige, selbstspaltende hammerhead Ribozym in die 3‘-UTR eingebracht. Dies sollte ligandabhängig zur Degradation der viralen RNA führen. Als Testsystem wurde ein SFV Replikon verwendet, welches für GFP statt der Strukturproteine codiert. Dadurch konnte die Replikation über die GFP-Expression beobachtet werden. Trotz intensiver Optimierung der Infektions- und Schaltbedingungen konnte mit keinem Konstrukt eine signifikante Regulation erreicht werden. In einem zweiten Projekt sollte das alternative Spleißen mit Hilfe eines TetR bindenden Aptamers kontrolliert werden. Hierzu wurde ein Minigen eingesetzt, welches das Aptamer direkt downstream der 5’-Spleißstelle im Intron enthält. Das Aptamer kontrolliert dadurch ligandabhängig den Zugang zur Spleißstelle. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Expression von TetR der Spleißprozess behindert wurde. Die Zugabe von Doxycyclin, welches in TetR eine Konformationsänderung induziert und die Bindung an das Aptamer inhibiert, ermöglichte das Spleißen wieder. Es wurden verschieden starke 5‘- und 3‘-Spleißstellen sowie unterschiedlich stabile Aptamere getestet. Eine starke Spleißstelle und ein destabilisiertes Aptamer bewirkten die stärkste Regulation. Zusätzlich wurde das Aptamer auch in einem anderen Minigen erfolgreich getestet. Das System wurde daraufhin in den Kontext einer mRNA überführt. Hierzu wurden die besten Intron-Aptamer-Kombinationen aus dem Minigen an verschiedenen Stellen in das Luziferasegen inseriert. Der stärkste Regulationsfaktor lag bei 1,7. Das zeigt, dass die im Minigen erhobenen Daten nicht direkt auf einen mRNA-Kontext übertragbar sind und an den neuen Kontext angepasst werden müssen. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde der Rec-RcRE-Komplex des humanen endogenen Retrovirus HERV-K untersucht, welcher für den Export gespleißter und ungespleißter viraler RNA notwendig ist. Es konnte gezeigt werden, dass purinreiche Motive (GGAA-, GGA- und AAGG-Motiv) an der Bindung beteiligt sind. Allerdings war die Dissoziationskonstante der Motive allein 50-fach schlechter als die des gesamten RcRE Elements. Mutationsanalysen und Exportstudien führten zu einem Bindungsmodell, wonach Rec in erster Linie an die zentrale Region der komplex gefalteten Struktur des RcRE pck30 bindet, gefolgt von einer kooperative Bindung an die weniger affinen, purinreichen Bindungsmotive. Vermutlich wird der Exportkomplex aus Rec und dem RcRE durch die Bindung von Rec an die purinreiche Motive stabilisiert.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
In this thesis synthetic RNA switches were developed to regulate cellular processes on RNA level. In the first part the viral replication of the RNA virus Semliki Forest Virus (SFV) was regulated. Therefore the tetracycline binding aptamer was inserted in the subgenomic promoter region. Here the ligand bound aptamer interferes with the recognition of the promoter. Additionally, the self cleaving, theophylline depended hammerhead ribozyme was inserted in the 3’ UTR. Thus the degradation of the viral RNA is controlled by the ligand. Although the infection and regulation was optimized, no significant regulation was achieved. In the second part of the thesis alternative splicing was regulated by the TetR binding aptamer. A minigene was used and the aptamer was inserted downstream of the 5’ splice site. Here the aptamer controls the accessibility of the splice site dependent on the presence of ligand. It was shown that splicing was constricted by the expression of TetR. The addition of doxycycline resulted in a conformational change of TetR and thus the binding to the aptamer is inhibited. This leads to splicing again. Different 5’ and 3’ splice sites were tested and the stability of the aptamer was optimized. The best regulation was achieved with strong splice sites and a destabilized aptamer. Additionally, the aptamer was successfully used in a different minigene. Next this aptamer based switch was used in an mRNA context. Therefore the best intron-aptamer combination of the minigene was inserted in the luciferase gene. The best regulation factor was 1.7 . Thus the data of the minigene cannot be transferred directly to a new context. In the last part of this thesis the Rec-RcRE complex of the human endogenous retrovirus HERV-K was analyzed. It is necessary for the export of spliced and unspliced viral RNA. It was shown that purine rich motifs (GGAA-, GGA- und AAGG-motif) are important for binding. The dissociation constant of the motifs alone is 50 times higher than the one for the complete RcRE element. On the basis of data of mutation analysis and export studies a binding model was developed. Here Rec binds first to the central region of the complex folded RcRE pck30, followed by a cooperative binding to the purine rich motifs with less affinity. We assume that the export complex of Rec and the RcRE is stabilized by the purine rich motives.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Synthetic Genetic Circuits
Date Deposited: 10 Mar 2014 13:37
Last Modified: 10 Mar 2014 13:37
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-37463
Referees: Süß, Prof. Beatrix and Thiel, Prof. Gerhard
Refereed: 19 December 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3746
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