TU Darmstadt / ULB / TUprints

Trypanosoma brucei editosomes have a single, bifunctional reaction center - Evidence for a non-collisional reaction mechanism

Katari, Venkata Subbaraju :
Trypanosoma brucei editosomes have a single, bifunctional reaction center - Evidence for a non-collisional reaction mechanism.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2014)

[img]
Preview
Text
Katari_PhD_thesis.pdf
Available under Creative Commons Attribution Non-commercial No Derivatives, 2.5.

Download (49MB) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Trypanosoma brucei editosomes have a single, bifunctional reaction center - Evidence for a non-collisional reaction mechanism
Language: English
Abstract:

Most mitochondrial transcripts in African trypanosomes are edited to generate translatable transcripts. The reaction is catalyzed by a macromolecular protein complex, the 20S editosome. Editing is characterized by the site-specific insertion and/or deletion of exclusively U nucleotides and in order to catalyze the reaction, editosomes must bind a panel of different substrate pre-mRNAs.

The experiments documented in chapter one verify that 20S editosomes bind different “in vivo-sized” transcripts with nanomolar affinities and association/dissociation rate constants typical for RNA/protein complexes. The editosome/RNA interaction is non-discriminative, thus enabling the interaction with different pre-edited mRNAs as well as with partially edited mRNAs and guide RNAs. Using immunogold-labeling in combination with transmission electron microscopy (TEM) I was able to demonstrate that editosomes have only one RNA substrate-binding site, which suggests that both subtypes of the RNA editing reaction (U-insertion and U-deletion) are catalyzed within a single, bifunctional reaction center.

In chapter two I present the first atomicforce microscopy (AFM)-based pictures of 20S editosomes and 20S editosome/RNA complexes. The data confirm that editosomes have a single RNA binding domain and further demonstrate that editosomes contain a so far unknown “chaperone-type” RNA unwinding activity. Upon RNA binding, transcripts become progressively unwound, ultimately enabling multiple 20S editosomes to interact with one substrate RNA.

RNA editing is a pre-requisite for the survival of Trypanosoma brucei. The life cycle of the parasite involves the cyclic transmission between a mammalian host and the Tsetse fly as the insect vector. Since RNA editing has been shown to be regulated between the two developmental stages, I analyzed in chapter three whether RNA editing is also regulated within the cell cycle of the parasite. Editosome isolates from the G1- and G2-phase of the trypanosome cell cycle were tested for their RNA editing activity. The experiments identified catalytic activity in both phases thus demonstrating that the processing reaction is not cell cycle-regulated.

The basic steps of the editing reaction cycle have been unraveled with the help of an in vitro assay that is per-formed at dilute solvent conditions. However, in vivo the reaction takes place inside the highly “crowded” mitochondrial environment. In chapter four I analyzed the effects of macro-molecular crowding on RNA editing using defined conditions from dilute to semidilute to crowded solvent proper-ties. I was able to demonstrate that the thermodynamic stabilities of the pre-mRNA/gRNA hybrid RNAs differ at these conditions. Crowded solvent properties stabilize the RNA molecules and alter the rate constants for the association and dissociation of the substrate RNAs to editosomes. Ultimately, the processing reaction is inhibited. These results imply that the in vivo reaction cannot rely on a diffusionally-controlled, collision-based mechanism. The data advocate a scenario in which RNA editing is conducted by a “hand-over” or “channeling” of substrate RNAs from one processing machinery to the next.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die Mehrheit der mitochondrialen Transkripte in afrikanischen Trypanosomen muss editiert werden, um translatierbare mRNA-Moleküle zu generieren. Die Reaktion wird von einem makromolekularen Protein-komplex, dem sogenannten 20S Editosom, katalysiert. RNA-Editing zeichnet sich durch die Insertion und/oder Deletion von ausschliesslich U-Nukleotiden aus, und um die Reaktion zu initiieren müssen Editosomen mit den zu prozessierenden, prä-editierten mRNAs im Mitochondrium wechselwirken. Die in Kapitel eins dokumentierten Experimente zeigen, dass 20S Editosomen unterschiedliche mitochondriale Transkripte mit nanomolarer Affinität binden können. Die korrespondierenden Assoziations- und Dissoziationsraten-Konstanten entsprechen dabei typischen Werten für die Wechselwirkung von RNA-Molekülen mit Proteinen. Die Editosom/RNA-Interaktion ist nicht diskriminativ, wodurch Editosomen in der Lage sind mit unterschiedlichen prä-editierten mRNAs, mit partiell editierten mRNAs, als auch mit guide RNAs zu interagieren. Immunogold-Markierungsexperimente in Kombination mit einer Visualisierung durch Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (TEM) zeigten, dass Editosomen eine einzige Substrat-RNA Bindestelle aufweisen. Dies legt nahe, dass beide Editing-Partial-reaktionen (U-Insertion /U-Deletion) in einem bifunktionalen reaktiven Zentrum ablaufen. In Kapitel zwei werden die ersten Rasterkraftmikroskop-basierten Bilder von 20S Editosomen und 20S Editosom/RNA-Komplexen präsentiert. Die Darstellungen bestätigen, dass Editosomen eine einzige RNA-Bindedomäne haben. Fortführend zeigen die Daten, dass Editosomen eine bisher unbekannte, “chaperone”-artige RNA-Entwindungsaktivität exekutieren. RNA-Trankripte werden nach Bindung an den Proteinkomplex strukturell entwunden, letztlich um mehreren Editingkomplexen die Bindung an ein Substrat RNA-Molekül zu ermöglichen. RNA-Editing stellt eine Voraussetzung für das Überleben afrikanischer Trypanosomen dar. Der Lebenzyklus der Parasiten zeichnet sich durch die zyklische Übertragung zwischen einem Säugetierwirt und Tsetse-Fliegen als übertragendem Insekt aus. Da RNA-Editing zwischen diesen beiden Entwicklungsstadien (Fliege/Säugetierwirt) reguliert wird, wurde in Kapitel drei untersucht, ob die Editingreaktion ebenfalls innerhalb des Zellzyklus des Parasiten reguliert ist. Hierzu wurden Editosomen von Zell-zyklus-sychronisierten Trypanosomenzellen der G1- und G2-Phase präpariert. Die Experimente zeigen, dass in beiden Zellzyklusphasen katalytische Aktivität nachweisbar ist. D.h. RNA-Editing ist innerhalb des Zellzyklus nicht reguliert. Die basalen Reaktionsschritte der RNA-Editingreaktion wurden unter Verwendung eines biochemischen in vitro Systems identifiziert. Die Reaktion wird dabei in einem verdünnten, wässrigen Milieu durchgeführt, was ignoriert, dass die Editingreaktion in vivo innerhalb der Mitochondrien stattfindet. Mitochondrien zeichnen sich durch extreme makromolekulare “crowding”-Bedingungen aus. In Kapitel vier wird der Einfluss von verdünnten, “semiverdünnten” und “crowded” Reaktionsbedingungen systematisch untersucht. Die Experimente zeigen, dass sich die thermodynamischen Stabilitäten der prä-mRNA/gRNA-Hybrid RNAs ändern. “Crowded” Bedingungen stabilisieren die RNA-Moleküle. Gleichzeitig ändern sich die Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten für die Bildung der RNA/Editosom-Komplexe, was letztlich zu einer Inhibition der Reaktion führt. Hieraus ergibt sich, dass die Reaktion in vivo nicht diffusions-kontrolliert ablaufen kann. Die Ergebnisse legen einen Reaktionsweg nahe, bei dem die Substrat-RNAs der Editingreaktion von einer Prozessierungsmachinerie zur Nächsten weiter gereicht werden und nicht durch freie Diffusion migrieren. German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Postranscriptional Gene Regulation and RNA Therapeutics
Date Deposited: 14 Jan 2014 16:14
Last Modified: 14 Jan 2014 16:14
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-37387
Referees: Göringer, Prof. Dr. H. Ulrich and Hammann, Prof. Dr. Christian
Refereed: 6 December 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3738
Export:
Actions (login required)
View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year