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Cofilin 2 reguliert die Alcama-vermittelte Herzmorphogenese und Links-Rechts-Asymmetrie im Zebrabärbling

Braun, Helene :
Cofilin 2 reguliert die Alcama-vermittelte Herzmorphogenese und Links-Rechts-Asymmetrie im Zebrabärbling.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2013)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Cofilin 2 reguliert die Alcama-vermittelte Herzmorphogenese und Links-Rechts-Asymmetrie im Zebrabärbling
Language: German
Abstract:

Eine präzise Regulation der kardialen Morphogenese sichert eine effektive Herzfunktion. Im Vorfeld dieser Arbeit zeigte Dr. Benno Jungblut, dass das Zelladhäsionsmolekül Alcama (engl.: activated leukocyte cell adhesion molecule a) für die morphogenetischen Prozesse im Herzen des Zebrabärblings unerlässlich ist (unveröffentlichte Daten). Um die zellbiologische Grundlage der Alcama‐vermittelten Adhäsion zu entschlüsseln, sollten im Rahmen dieser Arbeit neue Interaktionspartner von Alcama identifiziert und charakterisiert werden. Durch Immunpräzipitation in Kombination mit massenspektrometrischer Analyse wurde das Aktin-regulatorische Protein Cofilin 2 als ein neuer Interaktionspartner von Alcama detektiert. Im Gegensatz zu der ubiquitären Isoform Cofilin 1 ist die Funktion der muskelspezifischen Form Cofilin 2 während der Embryonalentwicklung nur wenig erforscht. Daher lag der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit auf der funktionellen Charakterisierung von Cofilin 2 im Zebrabärblingembryo. Hier durchgeführte RNA‐Expressionsstudien zeigten eine zunächst ubiquitäre Expression von cofilin 2 (cfl2), die während der Segmentierungsphase auf die Augenlinsen, skelettale und kardiale Muskulatur, sowie das zentrale Nervensystem begrenzt wird. Mit Hilfe des Morpholino‐vermittelten Knockdowns von cfl2 konnte nachgewiesen werden, dass dieses Aktin‐bindende Protein die morphologischen Veränderungen myokardialer Zellen während der Schleifenbildung des Herzens kontrolliert. Weiterhin wird seine Funktion in dieser Entwicklungsphase für die korrekte Lokalisation von Alcama in der ventrikulären Kardiomyozytenmembran benötigt. Darüber hinaus ergaben immunchemische und konfokal‐mikroskopische Untersuchungen, dass Cofilin 2 die Anzahl der Kardiomyozyten Herzkammer‐spezifisch reguliert. Dabei limitiert Cofilin 2 in Abhängigkeit von Islet 1 die Differenzierung von Kardiomyozyten am venösen Pol, während es am arteriellen Pol die Mef2cb‐abhängige Differenzierung von Kardiomyozyten sowie von glatten Muskelzellen des Bulbus Arteriosus fördert. Des Weiteren ist Cofilin 2 an der Ausbildung der Links‐Rechts‐Asymmetrie beteiligt. Mittels in situ‐Hybridisierungen wurde eine randomisierte Expression des ersten asymmetrischen Markers southpaw infolge der cfl2‐Defizienz festgestellt. Die asymmetrische Genexpression wird im Zebrabärblingembryo durch das Kupffersche Vesikel (KV) etabliert, dessen Monozilien einen linksgerichteten Flüssigkeitsstrom erzeugen. Eine phänotypische Charakterisierung der cfl2‐defizienten Embryonen während der Gastrulation und der frühen Segmentierungsperiode brachte die Erkenntnis, dass Cofilin 2 für die Entwicklung eines funktionsfähigen KV benötigt wird. Cofilin 2 kontrolliert dabei die Clusterbildung und sichert das Überleben der KV‐Vorläuferzellen, den DFCs (engl.: dorsal forerunner cells). Zusätzlich konnte hier durch einen Doppel‐Knockdown gezeigt werden, dass Cofilin 2 in den Integrin‐αV1‐vermittelten Signalweg involviert ist, um die Bildung des DFC‐Clusters zu gewährleisten.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Precise regulation of heart morphogenesis ensures effective cardiac function. Previous work by Dr. Benno Jungblut has shown that activated leukocyte cell adhesion molecule a (Alcama) plays a critical role during morphogenetic processes in the zebrafish heart (unpublished data). To elucidate the cellular mechanism underlying Alcama‐mediated adhesion, a screening was performed to identify proteins that interact with Alcama. Immunoprecipitation followed by mass spectrometry analysis revealed the actin‐modulating protein Cofilin 2 as a novel interacting partner of Alcama. Whereas ubiquitously expressed Cofilin 1 is the best studied isoform, little is known about the muscle‐type Cofilin 2 during embryogenesis. Therefore, the focus of the present work was the functional characterization of Cofilin 2 in zebrafish embryos. Gene expression studies revealed ubiquitous cofilin 2 (cfl2) expression until segmentation stages, which is then restricted to skeletal and cardiac muscles, lenses and the central nervous system. Morpholino‐mediated knockdown of cfl2 showed that this actin‐binding protein controls morphological changes of myocardial cells during cardiac looping and chamber formation. Furthermore, Cofilin 2 is required to regulate the subcellular localization of Alcama in ventricular cardiomyocytes at the same stage. In addition, immunochemistry and confocal microscopy revealed that Cofilin 2 regulates the cardiomyocyte number in a chamber‐specific manner. Cofilin 2 is required to restrict the differentiation of atrial cardiomyocytes at the venous pole in an Islet 1‐dependent manner. In contrast, Cofilin 2 is important for promoting the Mef2cb‐dependent differentiation of ventricular cardiomyocytes as well as smooth muscle cells of the bulbus arteriosus at the arterial pole. In addition, this work demonstrated that Cofilin 2 plays a role in determination of left/right asymmetry of the heart and other visceral organs. Whole mount in situ hybridizations of cfl2‐deficient embryos showed a randomized expression of the Nodal‐homolog southspaw, the first marker for left‐right asymmetry. In zebrafish embryos asymmetric gene expression is established by Kupffer’s vesicle (KV), a ciliated organ generating a leftward fluid flow. Phenotypic characterization of cfl2‐deficient embryos during the gastrulation and early segmentation stages showed that Cofilin 2 is essential for the formation of a functional KV. Cofilin 2 controls the clustering and ensures the survival of the dorsal forerunner cells (DFCs), precursors of KV. Furthermore, a double knockdown demonstrated that Cofilin 2 is involved in Integrin‐αV1‐mediated signaling pathway during the regulation of the clustering of DFCs.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Developmental Biology and Neurogenetics
Date Deposited: 06 Dec 2013 10:13
Last Modified: 06 Dec 2013 10:13
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-36941
Referees: Layer, Prof. Dr. Paul G. and Kaldenhoff, Prof. Dr. Ralf and Braun, Prof. Dr. Thomas
Refereed: 22 October 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3694
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