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Molekularbiologische Charakterisierung von nicht-kultivierten Crenarchaeota und Acidobacteria in Metagenombanken aus Bodenproben

Quaiser, Achim :
Molekularbiologische Charakterisierung von nicht-kultivierten Crenarchaeota und Acidobacteria in Metagenombanken aus Bodenproben.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2003)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Molekularbiologische Charakterisierung von nicht-kultivierten Crenarchaeota und Acidobacteria in Metagenombanken aus Bodenproben
Language: German
Abstract:

Molekular-phylogenetische Studien, basierend auf der Charakterisierung von 16S rRNA-Genen, haben gezeigt, dass Bodenhabitate besonders reich an mikrobieller Diversität sind. So wurde z.B. eine bestimmte Gruppe der Crenarchaeota (Archaea), die bislang als Extremophile galten, durch 16S rDNA-Studien häufig in Bodenhabitaten entdeckt. Weiterhin konnte das Phylum der Acidobacteria, das derzeit von ca. 200 16S rDNA Umwelt-Sequenzen und von nur 3 kultivierten Vertretern repräsentiert wird, definiert werden. Es ist aufgrund seiner phylogenetischen Breite mit den Proteobacteria vergleichbar. Acidobacteria stellen häufig eine dominierende Fraktion der Mikroorganismen in Bodenhabitaten dar, sind jedoch bis heute ebenso wie die mesophilen Crenarchaeota weitgehend uncharakterisiert. Aus Mangel an geeigneten Techniken bleiben bislang insgesamt mehr als 99% der Mikroorganismen in den meisten Habitaten uncharakterisiert, weil sie nicht im Labor kultiviert werden können. Inspiriert von den schnellen Fortschritten der mikrobiellen Genomik wurde in dieser Arbeit die Strategie der Umweltgenomik auf Bodenhabitate angewendet, um erstmals mesophile, unkultivierte Crenarchaeota und Acidobacteria aus Böden zu charakterisieren. Voraussetzung dafür war die direkte Isolierung von hochmolekularer DNA aus Bodenproben, die aufgrund des Vorliegens von grossen Mengen an polyphenolischen Komponenten (Humin- und Fulvinsäuren) eine besondere Herausforderung darstellte. Es wurde eine Methodik entwickelt, die auf einer 2-phasigen Gelelektrophoresetechnik basierte, und die eine schnelle und reproduzierbare Isolierung von klonierbarer, hochmolekularer DNA aus unterschiedlichen Habitaten erlaubte. Von diesen Nukleinsäuren wurden komplexe Genbibliotheken mit großen Inserts konstruiert. Die Charakterisierung der Genbibliotheken zeigte, dass die in den Habitaten durch PCR-Studien dargestellte große mikrobielle Diversität tatsächlich auf genomischer Ebene ab-gebildet werden konnte. Mit Archaea-spezifischen und Acidobacteria-spezifischen Sonden wurden je ein Genomfragment der mesophilen nicht-kultivierten Crenarchaeota und der Acidobacteria aus einer 960 Mbp großen Fosmid-Genbank einer Bodenprobe isoliert und charakterisiert. Der archaeale Klon enthielt ein 34 kb Fragment, auf dem ein komplettes rRNA-Operon und 17 Protein-kodierende Gene lokalisiert waren. Die phylogenetischen Analysen der rRNA-Gene und eines Proteingens bestätigten die Zugehörigkeit des Genomfragments zur Gruppe der nicht-thermophilen Crenarchaeota. Die Genomstruktur und die auf dem Genomfragment lokalisierten Gene zeigten deutliche Unterschiede zu den bereits untersuchten, nahe-verwandten marinen Vertretern. Die detaillierte Analyse eines 35 kb Fragments der Acidobacteria bestätigte die Zugehörigkeit des Genomfragmentes zu dieser noch unbeschriebenen, ökologisch aber relevanten Gruppe. Durch vergleichende Genomanalysen und phylogenetische Rekonstruktionen wurden Hinweise auf einen horizontalen Gentransfer zwischen Rhizobiaceae (a-Proteobacteria) und Acidobacteria erhalten. Ein Bereich, der 10 kb mit 8 potentiellen Protein-kodierenden Genen überspannte, war colinear und zeigte große Sequenzähnlichkeiten mit einem Genombereich von Rhodopseudomonas palustris. Die Charakterisierung der Protein-kodierenden Gene ermöglichte erste Einblicke in das physiologische Potential der mesophilen Crenarchaeota und der Acidobacteria und stellt eine Basis für weiterführende genomische Untersuchungen dar.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
In my PhD thesis I investigated two groups of microorganisms from soil habitats in an environmental genomic approach. Molecular phylogenetic studies based on the characterisation of 16S rRNA genes have shown that soil habitats are particularly rich in microbial diversity. In contrast, due to the lack of adequate techniques, more than 99% of the microorganisms are still uncharacterised, because they can not be cultivated in the laboratory. Therefore I have applied an environmental genomic approach to characterisemicroorganisms on their genomic level without the need of cultivation. My studies involved members of the archaeal kingdom crenarchaeota which were considered until recently as extremophiles, exclusively residing in hot environments and Acidobacteria, a novel phylum within the Bacteria, which shows a similar phylogenetic depth as that of the Proteobacteria. The development of a method based on a 2-phase gel-electrophoresis allowed the isolation of highly pure and cloneable high molecular weight DNA from soil by elimination of polyphenolic compounds (humic and fulvic acids) which heavily contaminate soil DNA (Quaiser et al., 2002a and 2002b). With these nucleic acids complex large insert libraries (metagenomic libraries) containing more than 4 Gbp of soil DNA from three different habitats were constructed. Characterisation of the metagenomic libraries revealed that a large microbial diversity predicted by 16S rDNA surveys was reflected on the genomic level. With Archaea-specific and Acidobacteria-specific probes one genomic fragment of a mesophilic uncultured Crenarchaeota and six genomic fragments of the Acidobacteria (210.000 bp) from two fosmid libraries were identified and characterised (Quaiser et al., 2002a; Quaiser et al., 2003). The archaeal clone contained a 34 kb fragment with a complete rRNA operon and 17 genes encoding putative proteins. Phylogenetic analysis of the rRNA genes and of a protein gene confirmed the affiliation of the genomic fragment to the group of non-thermophilic Crenarchaeota. The genome structure and gene content showed significant differences to its thermophilic cultivated relatives. Sequence analysis of the six acidobacterial genomic fragments resulted in more than 210 kbp of genomic information from this phylum (Quaiser et al., 2003). The 16S rRNA genes of the genomic fragments differed between 2.3 and 19.9% and were phylogenetically placed into two different subgroups of Acidobacteria (groups III and V). Although partial co-linearity was found between the genomic fragments, the gene content around the rRNA operons was generally not conserved. Phylogenetic reconstructions with orthologs that were encoded on two of the six genomic fragments confirmed the coherence of the acidobacterial phylum. One genomic fragment harboured a cluster of 8 genes which was syntenic and highly homologous to genomic regions in Rhodopseudomonas palustris and Bradyrhizobium japonicum, including a conserved two-component system. Phylogenetic analysis confirmed that this similarity between Rhizobiales and Acidobacteria might be due to a horizontal gene transfer. In total, these data gave first insights into the genome content and diversity of the ubiquitously distributed but poorly characterised mesophilic Crenarchaeota from soil and the phylum of Acidobacteria. Furthermore, novel techniques were established that allow to characterise and exploit uncultivated microorganisms from soil and sediment samples by genomic analyses and heterologous expression studies.English
Uncontrolled Keywords: Moleculare Ökologie, Umweltgenomik, Boden, hochmolekulare DNA, nicht-kultivierte Crenarchaeota, nicht-kultivierte Acidobacteria, Metagenom
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
Moleculare Ökologie, Umweltgenomik, Boden, hochmolekulare DNA, nicht-kultivierte Crenarchaeota, nicht-kultivierte Acidobacteria, MetagenomGerman
Molecular ecology, soil, high molecular weight DNA, uncultured Archaea, uncultured Acidobacteria, metagenome, environmental genomicsEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:21
Last Modified: 07 Dec 2012 11:49
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000368
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-3687
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Pfeifer, Prof. Felicitas and Göringer, Prof. Ulrich
Advisors: Schleper, Dr. Christa
Refereed: 11 February 2003
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/368
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