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Isolierung und Charakterisierung hochaffiner Cystinknoten- basierter Matriptase-1 Inhibitoren

Glotzbach, Bernhard :
Isolierung und Charakterisierung hochaffiner Cystinknoten- basierter Matriptase-1 Inhibitoren.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2013)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Isolierung und Charakterisierung hochaffiner Cystinknoten- basierter Matriptase-1 Inhibitoren
Language: German
Abstract:

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Isolierung und Charakterisierung neuartiger hochaffiner Inhibitoren der humanen Typ II transmembranen Serinprotease (TTSP) Matriptase-1. In Publikationen der letzten Jahre wurde dieses proteolytische Enzym als neuartiger Biomarker verschiedener humaner Karzinome beschrieben und stellt somit einen möglichen diagnostischen sowie therapeutischen Ansatzpunkt dar. Ausgehend von den Cystinknoten-Peptiden SOTI-III sowie MCoTI-II sollten mittels Gerichteter Evolution neuartige Inhibitoren der Protease isoliert und anschließend charakterisiert werden. Hierfür wurde zunächst die Struktur des Cystinknotenpeptids SOTI-III aufgeklärt. Der Trypsininhibitor wurde zu diesem Zweck mittels Festphasenpeptidsynthese (SPPS) chemisch synthetisiert, oxidativ gefaltet, gereinigt und im Komplex mit Rinderpankreastrypsin kristallisiert. In Kenntnis detaillierter Strukturinformationen wurden für beide Ausgangsmoleküle strukturbasierte Bibliotheken mit bis zu 2 • 10^8 Varianten erstellt und diese auf der Oberfläche von Zellen der Bäckerhefe (S. cerivisiae) zur Durchmusterung bereit gestellt. Das Präsentationsverfahren wurde durch eine erfolgreiche Durchmusterung der SOTI-III Bibliothek nach Bindemolekülen der Protease Trypsin mittels fluoreszenzassoziierter Zellsortierung (FACS) validiert. Aus der Durchmusterung und Charakterisierung von Einzelklonen gingen neuartige Bindemoleküle hervor, wobei sich eine Inhibitionskonstante von 100 nM für eine synthetisierte Variante ergab. Für die Durchmusterung der Bibliotheken auf Bindemoleküle der humanen Matriptase-1 wurde die katalytische Domäne der Protease in E. coli als Einschlußkörper produziert und via Dialyse gefaltet. Im Anschluss wurden beide Variantenbibliotheken in jeweils 4 Selektionsrunden auf Bindemoleküle der katalytischen Matriptase-1 Domäne mittels FACS durchmustert. Gehäuft auftretende Einzelklone wurden im Folgenden für eine weitere Charakterisierung via SPPS synthetisiert, oxidativ gefaltet und gereinigt. Die potenteste Variante zeigte eine Ki von 0,8 nM sowie eine hohe Selektivität gegenüber Matriptase-1. Für die dominanteste Variante der SOTI-III Bibliothek lag eine Inhibitionskonstante von 29 nM vor. Um nun eine Aktivität der isolierten Inhibitoren gegenüber nativer Protease in vivo nachzuweisen, erfolgte eine Dosiswirkungsstudie mit einer Prostatakrebszellen (PC-3) unter Zellkulturbedingungen. Hierbei ergab sich eine halbmaximale Inhibitorkonzentration von 200 nM für den potentesten Inhibitor auf McoTI Basis, wohingegen nur eine geringe inhibitorische Aktivität der SOTI-Variante festgestellt wurde. Somit konnten aus den erstellten Variantenbibliotheken neuartige, potente sowie selektive Inhibitoren der humanen Matriptase-1 isoliert werden, die zusätzlich Aktivität gegenüber der nativen Protease aufweisen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
This study describes the isolation and characterization of new high affine inhibitors of the human Type II transmembrane serine protease (TTSP) Matriptase-1. In publications of the last years this proteolytic enzyme was described as a new biomarker of several human carcinomas. Therefore Matriptase-1 is a potential diagnostic and therapeutic starting point. Hence, new inhibitors of this protease should be generated by directed evolution based on the cystine knots SOTI-III and MCoTI-II. To generate structure based libraries of these molecules on the surface of the yeast Saccharomyces cerevisiae the structure of the cystine knot SOTI-III had to be solved. For this reason the molecule was synthesized via solid phase peptide synthesis (SPPS), oxidatively folded, and purified. After co-crystallization of SOTI-III in complex with bovine pancreatic trypsin the structure could be solved and variant libraries of both scaffold molecules with up to 2 • 10^8 clones were generated. Variants were produced in yeast S. cerivisiae and presented on the cell surface in multiple copies. The SOTI-III library was successfully screened for binding molecules of trypsin via fluorescent associated cell sorting (FACS). As a result of this screening and the characterization of single clones a miniprotein with an inhibition constant of 100 nM towards trypsin was identified. In the following the catalytic domain of matriptase-1 was produced as inclusion bodies in E. coli and refolded via dialysis. Four rounds of screening via FACS for Matriptase-1 binders were performed for both libraries. After single clone characterization most abundant variants were chemically synthesized, oxidatively folded, and purified for further characterization. One MCoTI-II variant exhibited a Ki of 0.8 nM as well as a high selectivity towards Matriptase-1. The best SOTI-III variant showed an inhibition constant of 29 nM for the protease. To prove the activity of the obtained inhibitors towards native enzyme a dose-response study on human pancreatic cancer cells (PC-3) was performed under cell culture conditions. This resulted in an IC50 value of 200 nM for the best MCoTI-related inhibitor, whereas nearly no activity was detected in case of the SOTI-III variant. In conclusion, potent, selective, and new inhibitors of human Matriptase-1 on could be isolated, which also show activity towards the native protease.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie
07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 29 Jul 2013 06:55
Last Modified: 29 Jul 2013 06:55
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-35427
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Neumann, Prof. Dr. Siegfried and Schmidt , Prof. Dr. Boris and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 19 June 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3542
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