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Untersuchung zur Relokalisierung heterochromatischer DNA Läsionen

Beuke, Marcus :
Untersuchung zur Relokalisierung heterochromatischer DNA Läsionen.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2013)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Untersuchung zur Relokalisierung heterochromatischer DNA Läsionen
Language: German
Abstract:

Die DNA in Säugerzellen ist um Histone gewunden und faltet sich zu höher geordneten Strukturen, welche man als Chromatin bezeichnet. Dieses wird in zwei Klassen aufgeteilt: das locker gepackte, transkriptionell aktive Euchromatin und das dicht gepackte heterochromatin (HC). Letzteres ist transkriptionell inaktiv, aber von entscheidender Bedeutung für die Regulation der Genexpression und die gesamte nukleäre Architektur. Obwohl das Heterochromatin durch seine dichte Packung eine besondere Herausforderung für die DNA Reparatur darzustellen scheint, ist wenig bekannt über den Ablauf der heterochromatischen Reparatur. In den meisten Studien wird nicht zwischen Eu- und Heterochromatin differenziert und da letzteres nur einen Anteil von etwa 20 % des Säugergenoms ausmacht, gehen die speziellen Anforderungen dieses besonderen Chromatinbereichs in solchen Studien unter. Durch die Verwendung gezielter Ionenbestrahlung wurde in dieser Arbeit die Relokalisierung heterochromatischer DNA Schäden aus den Chromocentern muriner Fibroblasten charakterisiert. Außerdem konnte gezeigt werden, dass das getroffene Chromatin nach gezielter schwerionenbestrahlung innerhalb von Sekunden dekondensiert. Die DNA Schäden wurden neben der Immunofluoreszenzmarkierung von Reparaturproteinen auch durch den direkten Nachweis mit Hilfe einer modifizierten TUNEL Analyse detektiert. Die Schäden relokalisieren innerhalb von etwa 20 Minuten aus dem Heterochromatin (HC) heraus. Dabei verliert das geschädigte Chromatin einen Teil seiner HC Marker wie H3K9me3, während andere HC Marker wie HP1α erhalten bleiben bzw. zusätzlich zu dem bereits gebundenen Anteil an den DNA Schaden rekrutiert werden. Der Prozess der Relokalisierung erwies sich als unabhängig von der Zellzyklusphase. Auch der LET (Linearer Energie Transfer) des Ions hatte keinen messbaren Einfluss auf die Relokalisierung. Darüber hinaus ließ sich diese auch nach Röntgenbestrahlung beobachten. Durch Relokalisierungsanalysen in ATM (Ataxia telangiectasie mutated) defizienten Fibroblasten konnte jedoch belegt werden, dass die Geschwindigkeit der Relokalisierung von ATM abhängt. Allerdings läuft der generelle Prozess grundsätzlich auch ohne diese Kinase ab. Der Heterochromatin-bildende Faktor KAP1, der mit der schadensinduzierten, ATM abhängigen Chromatindekondensation in Verbindung gebracht wurde, zeigte sich als unbedeutend für die Geschwindigkeit der Relokalisierung. So ließ sich die Relokalisierungsverzögerung in ATM defizienten Zellen nicht durch einen KAP1 knock down kompensieren. Neben ATM zeigten sich auch die anderen PIKK-Familien-Mitglieder ATR und DNA-PK für die Geschwindigkeit der Relokalisierung von Bedeutung. Die Kinasen scheinen dabei nicht vollständig redundant zu agieren. So hatte die DNA-PK Inhibition in ATM defizienten Zellen einen zusätzlich verlangsamenden Effekt auf die Relokalisierung. Dennoch konnte kein Hinweis darauf gefunden werden, dass die drei untersuchten PIK Kinasen einen Einfluss auf die Ausprägung der Dekondensation haben. Durch Immunofluoreszenzanalysen konnte gezeigt werden, dass die Reparatur heterochromatinassoziierter Schäden langsamer abläuft als die Reparatur euchromatischer Schäden und dass diese langsam reparierenden DNA Läsionen fast ausnahmslos mit Resektion assoziiert sind. Auch nach gezielter Bestrahlung von Chromocentern konnte die Resektion der ioneninduzierten DNA Schäden bereits innerhalb des Heterochromatins nachgewiesen werden. Der Resektionsmarker RPA war dabei oft von dem NHEJ (non homologous end joining) Faktor 53BP1 umgeben, ohne aber dass die beiden Proteine kolokalisierten. Diese spezielle Focusstruktur konnte auch mit Hilfe von hochauflösender Mikroskopie bestätigt werden und spricht für eine Konkurrenz der Reparaturwege um die DNA Schäden. Bei den hier beschriebenen Reparaturfocusstrukturen könnte es sich um sogenannte Reparaturzentren handeln, in denen mehrere DNA Schäden, wie sie entlang einer Ionentrajektorie entstehen, zusammen gezogen werden. Die Untersuchungen in dieser Arbeit liefern neue Einblicke in die DNA Schadensantwort im Heterochromatin und in die Reparatur heterochromatischer DNA Schäden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
In the mammalian cell nucleus DNA is highly compacted being wrapped around histones and folded into higher order structures building chromatin. Chromatin can be subdivided into two classes: the highly transcriptional active, loosely packed euchromatin and the densely packed heterochromatin (HC). Heterochromatin is transcriptionally inert but essential for the regulation of the gene expression and the entire architecture of the nucleus. Because of the dense packing of the DNA heterochromatin seems to represent a major challenge for DNA repair. However, little is known about the specific repair mechanism of heterochromatic DNA lesions. Most of the past repair studies did not differentiate between euchromatin and heterochromatin. Thus, representing only 20 % of the overall chromatin, the special requirements of the heterochromatic repair get lost in these studies. Making use of the unique submicrometer resolution of the GSI microprobe the distinct mouse heterochromatin chromocenters were precisely irradiated with single ions. This way it was possible to characterize the relocalization of heterochromatic DNA lesions out of the chromocenters of murine fibroblasts after aimed ion irradiation. The chromatin hit by ions was shown to decondensate within seconds after damage induction. DNA double strand breaks (DSBs) were tracked by visualization of DNA repair factors in a classical immunofluorescence detection approach and also traced directly in a modified TUNEL analysis. The ion induced DSBs relocated out of the heterochromatin within 20 minutes. Along the way the damaged chromatin showed loss of some of its heterochromatic markers including H3K9me3, while at the same time other markers such as HP1α were shown to be recruited in addition to the initial level. The process of damage relocalization demonstrated to be independent of the cell cycle phase. The analysis also showed that the LET (linear energy transfer) of the irradiation ion has no influence on the relocation. Furthermore, evidence for relocation after x-ray irradiation was found as well. However, relocation analyses in ATM deficient fibroblasts revealed that the speed of the relocation is dependent on ATM (ataxia telangiectasia mutated). Nevertheless, the general process of relocalization can in fact take place without this specific kinase. In contrast, the heterochromatin building factor KAP1, which is thought to be involved in the damage induced, ATM dependent chromatin decondensation was found to be dispensable for the relocalization speed of heterochromatic DNA lesions. Consequently, the relocalization delay in ATM deficient cells could not be compensated by an additional, RNAi driven depletion of KAP1. Besides ATM the other PIKK family members ATR and DNA-PK are relevant for the speed of relocalization as well. However, the data within this work suggest that these three kinases are not completely redundant for this process. Accordingly the inhibition of DNA-PK showed an additional delay of the relocalization in ATM deficient cells. However, no evidence was found that any of these three kinases has a major impact on the process of decondensation of damaged heterochromatin. Immunofluorescence analyses revealed that the repair of heterochromatin associated DNA lesions is slower than the repair of euchromatic lesions. Moreover, the slow DNA repair process was shown to be associated with resection in the majority of cases. DNA resection was detected already within the heterochromatin following its ion induced DNA damage. Interestingly, the applied resection marker RPA was often surrounded by the NHEJ factor 53BP1, but without distinctive colocalization of the two. This observation was validated by high resolution microscopy. The described structure suggests a competition of repair pathways for the DNA lesions. Based on the multiplicity of DSBs induced by charged particles, this structure could possibly display what is called repair centers. In these it is proposed that multiple DNA lesions are collected together. In Summary, the investigations in this thesis provide new insights into the DNA damage response in the heterochromatin and into the repair of heterochromatic lesions.English
Place of Publication: Darmstadt
Uncontrolled Keywords: Heterochromatin, Relokalisierung, Relokalosation, Dekondensation, Schwerionen, ATM
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 23 Jul 2013 14:01
Last Modified: 23 Jul 2013 14:01
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-35404
Referees: Durante, Prof. Marco and Löbrich, Prof. Markus
Refereed: 4 July 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3540
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