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Charakterisierung und neue Anwendungen nichtlinear optischer 3D-Mikroskopie

Petzold, Uwe :
Charakterisierung und neue Anwendungen nichtlinear optischer 3D-Mikroskopie.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2013)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Charakterisierung und neue Anwendungen nichtlinear optischer 3D-Mikroskopie
Language: German
Abstract:

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Mikroskop basierend auf der Frequenzverdopplung (SHG) und der Frequenzverdreifachung (THG) zur dreidimensionalen Visualisierung transparenter Proben aufgebaut. An diesem nichtlinear optischen Mikroskop wurde die Abhängigkeit der räumlichen Auflösung, der Konversionseffizienz und des transversalen Emissionsprofils von der Grenzflächenorientierung einer heterogenen Probe untersucht. Darüber hinaus wurde die THG-Mikroskopie erstmals auf das Forschungsgebiet der Mikrofluidik übertragen.

Der Einfluss der Grenzflächenorientierung auf die Emission der SHG und THG wurde an einer Quarzglaskapillare in einem brechungsindexangepassten Immersionsöl systematisch untersucht. Die dreidimensionalen Aufnahmen bzw. zwei-dimensionalen Schnitte der SHG-Mikroskopie (SHM) und der THG-Mikroskopie (THM) zeigten, dass die Richtung der Laserpolarisation keinen Einfluss auf die Konversionseffizienz und die räumliche Auflösung der THM-Aufnahme hat. Dies widerspricht früheren numerischen Simulationen, stimmt allerdings gut mit dem intuitiven Ansatz der Frequenzverdreifachung in isotropen Medien überein. Im Gegensatz dazu führt die Rotation der Laserpolarisation in der SHM zu einer großen Modulation der Signalstärke. Dies ist auf eine Anisotropie der schwachen Suszeptibilität zweiter Ordnung in Quarzglas zurückzuführen. Die Grenzflächenneigung bezüglich der Strahlachse beeinflusst die Signalstärke und die räumliche Auflösung, sowohl in der SHM wie auch in der THM. Im Gegensatz zu früheren, numerischen Simulationen ist die Intensität der zweiten und dritten Harmonischen an Grenzflächen parallel zur optischen Achse höher als an Grenzflächen orthogonal dazu. Dies korreliert mit der Größe der geometrischen Schnittfläche von Laserfokus und Grenzschicht. In der nichtlinear optischen Mikroskopie ermöglicht eine geschickte Wahl der Probenorientierung die Optimierung der räumliche Auflösung und des Signal-Rausch-Verhältnisses. Erstmals wurde das räumliche Emissionsprofil der dritten Harmonischen bei unterschiedlichen Grenzflächenorientierungen vermessen. Hierbei zeigte sich, dass nur an Grenzflächen senkrecht zur Strahlrichtung die erzeugte dritte Harmonische ein Gauß-Profil mit einem intensiven Maximum in Vorwärtsrichtung aufweist. Lediglich in dieser Geometrie beträgt der Durchmesser der dritten Harmonischen etwa 3^-(1/2) des Durchmessers des Laserprofils. Dieses Verhältnis deckt sich mit intuitiven, theoretischen Ansätzen der Frequenzverdreifachung. Wird die Grenzflächenneigung bezüglich der optischen Achse variiert, so ändert sich auch das Emissionsprofil der dritten Harmonischen signifikant. Mit Verringerung des Schnittwinkels zwischen der Grenzfläche und der Strahlachse entfernt sich das Maximum des THG-Emissionsprofils von der optischen Achse. Für nahezu longitudinal verlaufende Grenzflächen entsteht gegenüber dem Maximum ein zweites zunächst schwächeres Maximum. Die Intensität der beiden Maxima erreicht bei einer perfekt longitudinal verlaufenden Grenzfläche gleiche Werte. In diesem Fall liegen die beiden Maxima auf einem Emissionskegel, dessen Öffnungswinkel größer ist als jener des fokussierenden Objektivs. Das Emissionsprofil dreht sich bei Rotation der Grenzfläche um die optische Achse mit. Die Emissionsprofile bestätigen sowohl frühere, numerische Simulationen als auch die im Rahmen dieser Arbeit entstandenen Simulationen. Als wichtige Konsequenzen für die THM erfordert die Signalerfassung für moderate Fokussierungen eine numerische Detektionsapertur (entgegen der bislang in der Literatur vorherrschenden Meinung), die deutlich über jener des fokussierenden Objektivs liegt. Zudem ist bei multifokalen Ansätzen eine geeignete Abbildung auf den ortsauflösenden Detektor zu verwenden. Die Ablenkung des Intensitätsmaximums sowie das Intensitätsverhältnis der Maxima des Emissionsprofils der dritten Harmonischen eröffnet die Möglichkeit die Orientierung einer mikroskopischen Grenzfläche festzustellen, ohne dabei ein vollständiges dreidimensionales Bild aufnehmen zu müssen.

Die Methode der THM wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals auf das Forschungsgebiet der Mikrofluidik übertragen. Die THM-Aufnahmen zeigten eine hochauflösende Visualisierung von Phasengrenzen nicht-mischbarer Flüssigkeiten in einem mikrofluidischen System. Verglichen mit der typischerweise verwendeten Fluoreszenzmikroskopie müssen hier keine Marker verwendet werden, die Untersuchung temperaturempfindlicher Proben ist möglich und es werden alle Grenzflächen des Systems simultan abgebildet. In einem weiteren Experiment wurde die Ethanolkonzentration bei der Mischung von Ethanol und Wasser durch die Intensität der am Kanalboden erzeugten, frequenzverdreifachten Strahlung ermittelt. Das gemessene, zweidimensionale Profil zeigte die stationäre Konzentrationsverteilung eines fließenden, mikrofluidischen Systems. Durch die Anpassung theoretisch erwarteter Konzentrationsprofile gelang es einen Diffusionskoeffizienten von D = (460 ± 30)µm²/s zu bestimmen. Der ermittelte Koeffizient ist konsistent mit jüngsten, theoretischen Vorhersagen als auch mit früher gemessenen Werten in deutlich komplexeren Aufbauten. Die Ergebnisse zeigen eindrucksvoll das Potential der THM. Zudem Bedarf es keinen speziellen Anpassungen der typischerweise verwendeten, mikrofluidischen Systeme. Neben der Untersuchung von Diffusionen bzw. Mischungen ist es denkbar, auch wandnahe Temperaturgradienten oder Dynamiken chemischer Reaktionen mit der THM aufzunehmen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The thesis deals with nonlinear optical microscopy based on third harmonic generation (THG) and second harmonic generation (SHG). In particular, we experimentally study the effect of interface orientations upon the obtained spatial resolution, total yield and emission profile in second and third harmonic microscopy (SHM and THM). Moreover, the thesis contains the first application of THM in the emerging field of microfluidics. The first part of the thesis presents and discusses systematic experimental investigations with regard to the effect of laser polarization and interface orientation in SHM and THM. The test object is a fused silica capillary in an index-matched liquid, which is entirely invisible for conventional (linear) microscopy. The obtained high-resolution three-dimensional images and two-dimensional lateral cuts of the capillary SHM and THM reveal several characteristic features: First, the direction of the laser polarization plays no role for signal intensity and resolution in the THM image. Second, the direction of the laser polarization leads to a large modulation of the SHM yield. This is due to some residual second order anisotropy even in an amorphous material such as fused silica. Third, the interface orientation affects signal strength and spatial resolution, both in THM as well as SHM. This feature enables spatial characterization of the laser focus. As an (on the first glance) surprising feature, also interfaces oriented parallel to the laser beam direction yield strong harmonic signal. This is due to the larger effective area responsible for harmonic emission in this geometry. Additional experiments reveal a variation of the spatial profile of the emitted third harmonic with the orientation of the interface. The results show, that only at interfaces perpendicular to the direction of the fundamental laser beam, the THG emission profile shows a single intense spot in forward direction. When the interface orientation changes towards parallel with regard to the fundamental beam, the spatial profile of the emitted third harmonic varies significantly. In the case of interface orientations other than perpendicular, the third harmonic intensity profile moves outside the forward direction and develops into a double-spot beam with a large opening angle in between. The intensity ratio between the two intensity spots varies with the interface orientation. It increases towards unity for an interface parallel to the fundamental laser beam. The numerical aperture of the double-spot third harmonic beam exceeds the numerical aperture of the fundamental beam. These findings have important consequences for applications of THM. First, imaging of microscopic interfaces at arbitrary orientation requires THG signal collection at sufficiently large numerical aperture, i.e. beyond the numerical aperture of the fundamental beam. Second, double-spot THG emission profiles from interfaces of other than perpendicular orientation require careful design of multi-foci THM setups. Third, the dependence of THG emission with interface orientation offers possibilities to determine orientation angles of microscopic surfaces from the intensity distribution in THG emission profiles. The second part of the thesis demonstrates applications of THM in microfluidics. In particular, we image a microfluidic flow of nonmixing, transparent fluids by THM. Compared to the standard fluorescence microscopy, THM requires no labeling, staining or resonant excitation and visualizes all interfaces. Moreover, we image the near-surface diffusion of two miscible, transparent fluids (i.e. ethanol and water) in a microfluidic device by THM. After calibration with a pure water sample, the third harmonic yield is directly proportional to the ethanol concentration in the sample. Thus, the technique enables direct mapping of ethanol concentrations in microflows near a surface with a spatial resolution in the range of micrometers. From the image, we deduce a diffusion coefficient for ethanol/water samples of D = (460±30)µm²/s. The investigations clearly demonstrate the potential of THM, even under the challenging conditions of transparent fluids and similar refractive indices. This serves, for example, to obtain information on mixing processes, temperature gradients, or reaction dynamics in microfluidic devices, at large spatial resolution and without perturbation of the samples.English
Place of Publication: Darmstadt
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
third harmonic generation microscopy, second harmonic generation microscopy, characterization, different interface orientations, applications in microfluidicsEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
Divisions: 05 Department of Physics > Institute of Applied Physics
Date Deposited: 20 Jun 2013 15:35
Last Modified: 20 Jun 2013 15:35
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-34741
Referees: Halfmann, Prof. Dr. Thomas and Walther, Prof. Dr. Thomas
Refereed: 10 June 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3474
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