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Struktur und Funktion enzymatisch vernetzbarer Proteaseinhibitoren von Streptomyces mobaraensis

Zindel, Stephan :
Struktur und Funktion enzymatisch vernetzbarer Proteaseinhibitoren von Streptomyces mobaraensis.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2013)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Struktur und Funktion enzymatisch vernetzbarer Proteaseinhibitoren von Streptomyces mobaraensis
Language: German
Abstract:

Streptomyceten sind immobile Bodenbakterien mit einem Pilzmyzel-ähnlichen Wachstum. Um ihren Lebensraum und sich selbst gegen Fressfeinde zu verteidigen, produzieren sie eine Vielzahl bioaktiver Sekundärmetabolite. S. mobaraensis produziert u.A. drei proteinöse Inhibitoren gegen Proteasen unterschiedlicher Familien, die gleichzeitig Substrate einer intrinsischen Transglutaminase (TGase) sind. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung der codierenden Gene sowie eine weitergehende Charakterisierung der Proteine. Das Gen des Streptomyces-Papaininhibitors SPI wurde über molekularbiologische Methoden vollständig identifiziert. Auch gelang die heterologe Produktion in E. coli, jedoch blieb rSPI trotz unterschiedlicher Herstellungsverfahren inaktiv. Durch spätere Experimente stellte sich heraus, dass wtSPI aus einem Protein mit Bindestellen für Transglutaminase und einem Kofaktor besteht, und jener Kofaktor die eigentliche inhibierende Komponente ist. Die codierenden Gene des Streptomyces-Subtilisin- und TAMEP-Inhibitors SSTI sowie des Dispaseautolye-induzierenden Proteins DAIP wurden zusammen mit den Rodlinen, Chaplinen, der TGase-aktivierenden Metalloprotease TAMEP, sowie zwei TAMEP-verwandten Metalloproteasen, fünf Klasse 1- und einer Klasse 2-Signalpeptidase über vollständige Genom-sequenzierung und anschließenden Datenbankabgleich identifiziert. Die weitere biochemische Charakterisierung von DAIP zeigte nachweislich, dass es sich hierbei um ein Enzym handeln muss, jedoch konnte der Wirkmechanismus nicht bestimmt werden. In silico-Analysen der Proteinstruktur wiesen auf eine Aspartylprotease hin. Die bereits früher vorgenommene Einordnung von SSTI in die Familie der Streptomyces-Subtilisininhibitoren wurde durch die vollständige Proteinsequenz bestätigt. In silico-Analysen der Proteinstruktur weisen darauf hin, dass die für TGase putativ zugänglichen Aminosäuren und die Subtilisinbindestelle auf gegenüber liegenden Proteinhälften liegen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The immobile soil bacteria Streptomyces exhibit a fungus mycelium-like growth. To defend themselves and their habitat against nutrient-competitors they produce a variety of bioactive secondary metabolites. S. mobaraensis produces, among others, three proteinaceous inhibitors against proteases belonging to different families. Additionally, these three inhibitors were identified as intrinsic transglutaminase-substrates (TGase) from S. mobaraensis. The objective of this work was both, the identification of the coding genes as well as a further characterization of the above mentioned proteins. The Streptomyces papain inhibitor-coding gene (SPI) was analyzed via molecular biologic methods. The heterologous production of SPI in E. coli was successful, though despite completely different production procedures rSPI was inactive. Subsequent investigations proved that wtSPI is composed of a proteinaceous TGase substrate and a small molecule of unknown size and structure that is responsible for the protease inhibitory effect. The coding genes of Streptomyces subtilisin and TAMEP inhibitor (SSTI), dispase autolysis inducing protein (DAIP), three putative rodlins, one putative long and five putative short chaplins, the transglutaminase activating metalloprotease (TAMEP), two putative TAMEP-related metalloproteases, five putative class 1 and one putative class 2 signal peptidase were identified via complete genome sequencing and subsequent comparison with known peptides or sequences from related proteins from other Streptomyces, respectively. The following biochemical characterization of DAIP indicated an enzymatic activity, though the mechanism could not be illuminated. In silico-analysis of the structure of DAIP revealed that the protein belongs to aspartic proteases. Formally classification of SSTI belonging to Streptomyces subtilisin inhibitor-family was confirmed by the complete protein sequence. In silico-analysis of the structure of SSTI showed that the putative binding sites for TGase are located on one side of the protein whereas the binding side for subtilisin is located on the other side. English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
Divisions: 07 Fachbereich Chemie
07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 21 Jun 2013 06:18
Last Modified: 21 Jun 2013 06:18
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-34677
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Fuchsbauer, Prof. Dr. Hans-Lothar
Refereed: 27 May 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3467
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