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Expression und Analyse plasmodialer und antiplasmodialer Proteine in Pflanzen

Reichwein, Simone :
Expression und Analyse plasmodialer und antiplasmodialer Proteine in Pflanzen.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2013)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Expression und Analyse plasmodialer und antiplasmodialer Proteine in Pflanzen
Language: German
Abstract:

Auf der Suche nach neuen Möglichkeiten im Kampf gegen die Malaria werden auch innovative Ideen und neue, ungewöhnliche Strategien diskutiert und verfolgt, die angesichts zahlreicher Rückschläge bei der Anwendung etablierter Maßnahmen zunehmend an Bedeutung gewinnen. Der vorliegenden Arbeit liegt die Idee zugrunde, durch die Applikation inhibitorischer Proteine mittels transgener Pflanzen die Entwicklung des Parasiten im Vektor Anopheles zu hemmen und in der Folge die Malaria-Transmission zu reduzieren. Da auch weibliche Anopheles-Moskitos Pflanzensäfte als Zuckerquelle nutzen (Foster, 1995), sollte die Aufnahme der antiplasmodial wirksamen Proteine durch transgene Pflanzen erfolgen, welche die entsprechenden Proteine in ihrem Nektar akkumulieren. Die aufgenommenen Proteine sollten entweder mit Strukturen des Mitteldarms bzw. der Speicheldrüse von Anopheles oder den entsprechenden Entwicklungsstadien von Plasmodium interagieren, um in der Folge die Transmission des Parasiten auf den Menschen zu reduzieren. Ziele dieser Arbeit waren daher die Produktion entsprechender Kandidatenproteine, die Evaluation ihrer antiplasmodialen Wirksamkeit in Fütterungsexperimenten mit Anopheles sowie die Etablierung von Ricinus communis als pflanzliches Applikationssystem der antiplasmodialen Proteine.

In den vergangenen Jahren konnten verschiedene Proteine identifiziert werden, die durch eine Interaktion mit den Sexualstadien von Plasmodium die Entwicklung des Parasiten inhibieren und so eine Übertragung reduzieren können. Nachdem für das synthetische Dodecapeptid salivary gland and midgut peptide 1 (SM1-Peptid; Ghosh et al., 2001) in transgenen Moskitos eine Inhibition der Entwicklung von Plasmodium gezeigt werden konnte (Ito et al., 2002), stellte sich in der vorliegenden Arbeit die Frage, ob diese Wirkung auch nach einer oralen Aufnahme dieses Peptids bzw. weiterer Kandidatenproteine durch Anopheles nachgewiesen werden kann. Um die antiplasmodiale Wirksamkeit in Fütterungsexperimenten mit Anopheles untersuchen zu können, wurden daher verschiedene Varianten des SM1-Peptids sowie der antiplasmodial wirksamen Peptide PcFK1 und PcFK2 aus dem Toxin von Psalmopoeus cambridgei (Choi et al., 2004) im bakteriellen und transienten pflanzlichen Expressionssystem produziert und charakterisiert. Dabei konnte durch den positiven Nachweis der trypsininhibitorischen Aktivität des zur Erhöhung der Stabilität als Grundgerüst verwendeten Cystin-Knoten-Mikroproteins MCoTI-II die korrekte Faltung der in den beiden verschiedenen Expressionssystemen produzierten Proteine gezeigt werden. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit am Beispiel des CKM MCoTI-II aus Momordica cochinchinensis zum ersten Mal die rekombinante Produktion eines funktionellen Cystin-Knoten-Mikroproteins in Pflanzen beschrieben werden. Weiterhin konnten als plasmodiale Antigene die A-Domäne des thrombospondin-related anonymous protein (TRAP) der Sporozoiten von P. berghei, die Ookineten-Oberflächenproteine P25 und P28 von P. falciparum sowie das Speicheldrüsenprotein Saglin von Anopheles als Zielstruktur des Vektors im bakteriellen Expressionssystem produziert werden. Die Proteine konnten daher zur Gewinnung antiplasmodialer Antikörperfragmente verwendet werden, die in zukünftigen Arbeiten ihrerseits als transmissionsblockierende Proteine angewandt werden können. Als Applikationssystem für antiplasmodiale Proteine erscheint in diesem Zusammenhang der in tropischen und subtropischen Ländern weit verbreitete Ricinus communis mit seinen extra-floralen Nektarien geeignet, wenn diese im Phloemsaft bzw. im Nektar akkumuliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass phloemspezifische Proteine auch in den Nektar der Pflanze sezerniert werden. Daher wurde die stabile Expression der inhibitorischen Peptide unter Verwendung des phloemspezifischen SUC2-Promotors aus A. thaliana (AtSUC2) in R. communis versucht. Da Ricinus jedoch nur äußerst schwer zu transformieren und regenerieren ist, konnte ein Nachweis der inhibitorischen Kandidatenproteine im Nektar im gegebenen Zeitrahmen aber nicht erreicht werden. Die Untersuchung der antiplasmodialen Wirksamkeit der Kandidatenproteine auf P. berghei erfolgte in Fütterungsversuchen mit infizierten A. stephensi, wobei jedoch keine signifikante inhibitorische Wirksamkeit der in diesem Rahmen getesteten Proteinvarianten beobachtet werden konnte. Da diese Ergebnisse jedoch als erste Tests dieses Ansatzes zu verstehen sind, sollten sich hier weitere Untersuchungen anschließen.

Zusammenfassend konnte diese Arbeit die Grundlagen für die Entwicklung eines alternativen Ansatzes legen, der letztendlich zusammen mit anderen, bereits etablierten Strategien und Maßnahmen, wie z. B. dem Einsatz von Insektiziden und insektizid-beschichteten Bettnetzen oder der Behandlung mit Malaria-Therapeutika, zur Senkung der Transmission der Malaria beitragen könnte.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
In search of new ways of fighting malaria innovative ideas and unusual strategies are increasingly discussed and pursued due to numerous setbacks in the application of established measures. The present work is based on the idea of interfering with Plasmodium development in its mosquito vector by the application of inhibitory proteins via transgenic plants, thus reducing malaria transmission. As even female Anopheles mosquitoes utilize plant nectars as a common sugar source (Foster, 1995), the uptake of Plasmodium-inhibitory proteins should be feasible via transgenic plants that accumulate the relevant proteins in their nectar. The ingested proteins are supposed to interact with surface structures of both the Anopheles gut and salivary glands, or with the relevant Plasmodium life-cycle stages, and subsequently reduce transmission of the parasite to humans. In this approach, the particular objectives were the production of the relevant candidate proteins, the evaluation of their inhibitory efficacy in Anopheles feeding experiments, and the establishment of Ricinus communis as a plant delivery system of the antiplasmodial proteins. In recent years, several proteins have been identified as being capable of interfering with the Plasmodium sexual stages, thus inhibiting the development of the parasite, and therefore, the transmission to humans. Since the synthetic dodecapeptide, salivary gland and midgut peptide 1 (SM1 peptide; Ghosh et al., 2001), revealed an inhibitory effect on Plasmodium development in transgenic mosquitoes (Ito et al., 2002), it should be evaluated, whether this effect could also be detected after oral ingestion of the peptide or other inhibitory proteins. To investigate the inhibitory activity in feeding experiments with Anopheles, different variants of both the SM1 peptide and the antiplasmodial peptides from the venom of Psalmopoeus cambridgei, PcFK1 and PcFK2 (Choi et al., 2004), were produced via bacterial and plant expression systems. It was shown by the detection of trypsin inhibition of the stabilizing microprotein scaffold MCoTI-II, that plant and E. coli produced proteins exhibit correct folding. In addition, this work is the first report on the recombinant production of a functional cystine-knot microprotein in plants using MCoTI-II from Momordica cochinchinensis. Furthermore, both, the A-domain of P. berghei thrombospondin-related anonymous protein (TRAP) and the ookinete surface proteins P25 and P28 of P. falciparum as plasmodial antigens, as well as the Anopheles salivary gland protein, saglin, could be produced via bacterial expression. Thus, these proteins could be provided for the recovery of antiplasmodial antibody fragments, which subsequently could also be investigated as transmission blocking proteins. In this context Ricinus communis, which is widespread throughout tropical and subtropical regions and possesses many extra floral nectaries, appears to be suited for the application of antiplasmodial proteins if they were expressed in the phloem sap or nectar, respectively. In the present study, it was shown that phloem specific proteins are secreted into the nectar. Thus, the stable expression of the relevant proteins in R. communis under the control of the phloem specific SUC2-promoter of A. thaliana (AtSUC2) was attempted. Though, since Ricinus is recalcitrant to in vitro regeneration and transformation, detection of the inhibitory candidate proteins in the Ricinus nectar was not feasible within the predetermined time-limit of the project. The inhibitory potential of the relevant proteins was investigated in A. stephensi feeding experiments using P. berghei parasites. However, under the selected conditions, no significant inhibitory effect could be detected. As these results were obtained in the first crude experiments of the proposed approach, further investigation should be conducted. In conclusion, this study provided the basis for the development of an innovative approach, additional to the established strategies and interventions, such as insecticides, insecticide-treated bed nets and antimalarial drugs, for the reduction of malaria transmission. English
Place of Publication: Darmstadt
Uncontrolled Keywords: Malaria, Plasmodium, antiplasmodiale Proteine, transgene Pflanzen, Anopheles
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Plant Biotechnology and Metabolic Engineering
10 Department of Biology > Microbial Energy Conversion and Biotechnology
Date Deposited: 18 Jul 2013 06:37
Last Modified: 03 Aug 2016 07:33
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-33978
Referees: Warzecha, Prof. Dr. Heribert and Bertl, Prof. Dr. Adam
Refereed: 15 February 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3397
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