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Kinetische Untersuchungen zum Zusammenhang von Sequenz, Struktur und Funktion der Hammerhead Ribozyme

Kalweit, Anne :
Kinetische Untersuchungen zum Zusammenhang von Sequenz, Struktur und Funktion der Hammerhead Ribozyme.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2013)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Kinetische Untersuchungen zum Zusammenhang von Sequenz, Struktur und Funktion der Hammerhead Ribozyme
Language: German
Abstract:

Das Hammerhead Ribozym (HHRz) ist die kleinste bekannte katalytische RNA und katalysiert die Spaltung und Ligation des eigenen Phosphordiesterrückgrads durch eine Umesterungsreaktion (SN2-Reaktion; Lilley, 2003). Die Minimalstruktur der HHRz besteht aus einer hochkonservierten katalytischen Core-Region und drei flankierenden Helices mit variablen Längen. Natürlich vorkommende HHRz werden anhand der Helix die nicht durch einen Hairpin Loop geschlossen ist, in drei verschiedene Typen eingeteilt. Die katalytische Aktivität der HHRz ist abhängig von verschiedenen Faktoren, zum einen vom Vorhandensein von divalenten Metall-Ionen und zum anderen von Tertiärinteraktionen zwischen den Loops1 und 2 bzw. den Helices I und II. Basierend auf der Tatsache, dass Interaktionen zwischen den Loops1 und 2 bzw. zwischen den Helices I und II für eine effiziente Faltung und schnelle Spaltungskinetiken verantwortlich sind, könnten für die HHRz kombinierte Sequenz- und Strukturbeschreibungen erstellt werden. Mit diesen ist es möglich gezielt Datenbanken nach genomisch codierten HHRz zu durchsuchen. So konnten in Zusammenarbeit mit Carsten Seehafer und dem von ihm entwickelten Programm RNAhit, welches auf Sequenz- und Strukturmotiven sowie auf thermodynamischen Faltungsparametern basiert, eine Vielzahl von Typ III HHRz in allen Bereichen des Lebens identifiziert werden. Jedoch kann durch diese Suchen nicht zwischen HHRz unterschieden werden, die nur den Musterbeschreibungen entsprechen und solchen die katalytisch funktionell sind. Somit sollte anhand von 19 ausgewählten primären HHRz Treffern, aus Xenopus tropicalis, Arabidopsis thaliana und Arabidopsis lyrata, die katalytische Aktivität in in vitro Spaltungsexperimenten untersucht und anhand der Ergebnisse die Filtereinstellungen bestätigt oder optimiert werden. Der ∆G-Wert ist ein Maß für die thermodynamische Stabilität einer Molekülstruktur und somit, neben der freien Faltung in ein HHRz, eines der wichtigsten Filterkriterien bei der Suche nach katalytisch aktiven HHRz. Alle ausgewählten primären Treffer zeigten einen ∆G0 37°C, free-Wert von ≤ -10 kcal/mol und unterschiedliche ∆∆G0-Werten. In in vitro Spaltungsanalysen in Anwesenheit von 2 mM MgCl2 konnten für acht der insgesamt 19 analysierten HHRz in Abhängigkeit von der Zeit eine autokatalytische Aktivität beobachtet werden. Dabei zeigten die HHRz Motive Xetr1, 2, 4, 5, 7 und 8 aus X. tropicalis, Arly3 aus A. lyrata und das als Positivkontrolle eingesetzte Ara1 Motiv die Spaltung des full length Transkripts in die beiden Spaltprodukte. In einem anschließenden Vergleich der Sequenzen, Sekundärstrukturen und thermodynamischen Parameter der spaltenden und nicht spaltenden HHRz, konnten die Filtereinstellungen zur Identifizierung katalytisch aktiver HHRz wie folgt angepasst werden: Der ∆∆G0-Wert sollte  0 sein, die freie Faltung sollte die typische HHRz Sekundärstruktur ausbilden und die Helix-Regionen I und II sollten keine Wobble-Basenpaarung (U-G oder G-U) aufweisen. Nach Anwendung des angepassten Analyseprogramms konnten für A. thaliana aus den anfänglich 988 Treffern lediglich die beiden schon bekannten katalytisch aktiven HHRz, Ara1 und Ara2, gefunden werden. Im Falle von A. lyrata konnte unter den 1490 gefundenen HHRz Motiven ein Treffer, mit einer Sequenzhomologie von 99% zu Ara1 aus A. thaliana, identifiziert werden und für X. tropicalis konnten aus der Großzahl der primären Treffer (4976) noch 6 katalytisch aktive HHRz herausgefiltert werden. Somit stellt sich heraus, dass nicht jedes den Musterbeschreibungen entsprechende HHRz Motiv katalytische Eigenschaften besitzt und dass es einer spezifischen Filtereinstellung zur Identifizierung von aktiven HHRz bedarf. Des Weiteren konnten die 6 neu identifizierten HHRz aus X. tropicalis auf genomischer DNA amplifiziert werden, wobei nicht für alle Motive eine 100%ige Übereinstimmung zu den in der Datenbank hinterlegten Sequenzen festgestellt werden konnte. Lediglich die beiden hochkonservierten Motive Xetr7 und 8 zeigten eine 100%ige Homologie und wurden in Abhängigkeit ihrer genomischen Umgebungssequenz in vitro auf ihre katalytische Aktivität geprüft. Dabei konnte entgegen aller Erwartungen festgestellt werden, dass in der Umgebungssequenz von Xetr7 und 8 zusätzliche katalytisch aktive HHRz vorhanden sind, die mit den zuvor beschriebenen Analyseprogramm RNAhit nicht gefunden werden konnten. Weiterhin konnte mittels einem S1 Nuklease Protektionassay die Expression dieser hochkonservierten Region in verschiedenen Geweben von X. tropicalis gezeigt werden. Die Ausbildung der katalytisch aktiven Form eines HHRz beruht auf tertiären Interaktionen zwischen den Loops1 und 2 und es spielen die hochkonservierten Nukleotide der Core-Region eine entscheidende Rolle. So konnte in diesem Zusammenhang bereits in zahlreichen Studien gezeigt werden, dass diese tertiären Interaktionen die Aktivität natürlich vorkommender HHRz erhöhen und die Abhängigkeit der Magnesiumkonzentrationen auf einen in der Zelle vorhandenen physiologischen Wert senken. In diesem Zusammenhang konnten, neben den in vitro Spaltungsanalysen erstmals auch ein von Stephan Wiegand in Dictyostelium discoideum etabliertes ß-Gal Reportersystem zur in vivo Analyse der katalytischen Aktivität der HHRz Motive unter physiologischen Bedingungen genutzt werden. Somit wurden PolyC-Loop Mutanten von vier unterschiedlichen Typ III HHRz Wildtypsequenzen (Xetr2 und 5, PLMVd, Ara1) in vivo und in vitro analysiert. Dabei stellte sich heraus, dass die Ausbildung von tertiären Interaktionen zwischen den Loops1 und 2 über nicht Watson-Crick Basenpaare in den verschiedenen Organismen nicht denselben Einfluss auf die katalytische Aktivität haben. So wiesen alle PolyC-Loop1 Mutanten eine ähnliche Aktivität wie der WT auf, wogegen die PolyC-Loop2 Mutanten eine deutlich verringerte Aktivität zeigten. Dies deutet darauf hin, dass die Substitution der Loop2 Nukleotide zu Cytosinen die Interaktion mit Loop1 verringert, wodurch den WT Nukleotiden in Loop2 eine für die katalytische Aktivität entscheidende Rolle zukommt. Lediglich bei den PLMVd C-Loop Mutanten konnte im Spaltungsverhalten kein nennenswerter Unterschied im Vergleich zum WT festgestellt werden. Somit sprechen die Ergebnisse deutlich für die Ausbildung von individuellen tertiären Interaktionen zwischen den Loop1 und Loop2 Sequenzen bzw. den Helices I und II, wodurch die aktive Konformation des HHRz stabilisiert wird. Des Weiteren zeigt die Core-Region der HHRz eine hochkonservierte Sequenz bestehend aus 11 Nukleotiden, dabei ist die Spaltstelle so definiert, dass an Position 17 ein A, C oder U aber kein G vorhanden sein sollte. Im Falle eines G an dieser Position sollte es zu einer Basenpaarung mit dem gegenüberliegenden C an Position 3 kommen, somit sollte die Spaltstelle blockiert werden und keine aktive HHRz Konformation ausgebildet werden (Ruffner et al., 1990). Unter dieser Voraussetzung sollte die G17 Mutante zunächst als interner Größenstandard für das WT Motiv in der in vitro Transkription dienen. Jedoch zeigten diese in vitro Experimente eine katalytische Aktivtiät der G17 Mutanten, welche anschließend auch unter physiologischen Bedingungen in in vitro und in vivo Experimenten bestätigt werden konnten. Auffällig war, dass sie deutlich geringere Spaltungseffizienzen als die WT Sequenzen hatten, was mit der Ausbildung des G17C3 Basenpaares zusammenhängen könnte und dessen Einfluss auf die Bildung des für die katalytische Aktivität erforderlichen C3G8 Basenpaares. Anhand der erhaltenen Ergebnisse für die Funktionalität der G17 Mutante konnten diese Varianten auch im Genom von X. tropicalis, A. thaliana und S. mansoni identifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass diese Motivvariationen der HHRz ähnlich häufig in den verschiedensten Organismen zu finden waren wie die C17 Motive und mit ihrer verringerten katalytischen Aktivität eine besondere Rolle in der Zelle spielen könnten. Mittels der Datenbanksuchen und experimentellen Analysen konnte ein Einblick über die Variabilität und Verbreitung der HHRz erhalten werden, wodurch jedoch die Suche nach der biologischen Funktion der HHRz in der Zelle deutlich erschwert wird.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The hammerhead ribozyme (HHRz) is a RNA with self-cleavage activity that was originally discovered in sub-viral plant pathogens and later also found in several other genomic locations. Formally, the structure of the hammerhead ribozyme is composed of three helices that surround a catalytic core of 11 conserved nucleotides. In addition to these requirements of a minimal hammerhead, all natural examples of this motif feature loops or bulges in the helical arms I and II. These interact and thereby allow for catalysis at physiological Mg2+ concentration. Using a secondary structure based descriptor, we performed a genome-wide RNA-motif search in several DNA sequences of eukaryotic, bacterial and viral entities from different public sources. Over half a million sequences fulfilled the descriptor and after several filter steps we could identify more than 150 novel, possible hammerhead ribozymes from more than fifty eukaryotes. The filter steps included folding and stability parameters and were validated with in vitro cleavage assays of 19 potential motifs of Xenopus tropicalis, Arabidopisi thaliana and Arabidopsis lyrata. Only eight of the analysed hammerhead ribozymes show autocatalytic activity. Initial S1 Nuclease Protection Assay reveal that the HHRzs from Xenopus tropicalis are expressed in several tissues. The expression in various tissues and in vitro activity of the HHRzs suggest an unidentified biological function. Natural hammerhead ribozymes (HHRz) feature tertiary interactions between two of three helices that surround the catalytic core of conserved nucleotides. Their conservation had originally been established on minimal versions lacking the tertiary interactions. While those sequence requirements in general also apply to natural versions, we show here differences for the HHRz cleavage site N17 and the tertiary interacting loops. A guanosine at position 17 strongly impairs cleavage activity in minimal sequences, whereas we observe for the G17 variants of four tertiary stabilized HHRz significant cleavage and ligation activity in vitro. In order to understand the self-cleavage behavior of these HHRzs variants in live cells we developed an in vivo reporter system in the slime mold Dictyostelium discoideum, where we analysed selected ribozymes derived from Arabidopsis thaliana, Peach Latent Mosaic viroid and Xenopus tropicalis and compared the results with cleavage activity in vitro. Kinetic analyses of these variants revealed reduced speed and extent of cleavage, compared to wild type sequences, while variants with distorted tertiary interactions cleaved at reduced velocity, but to the same extent. We propose these differences be attributable to a conformational change in G17-containing HHRz that precedes catalysis. To also address the catalytic performance of these motifs in vivo, we have inserted HHRz cassettes in the lacZ gene and tested this β-Galactosidase reporter in Dictyostelium discoideum. In colorimetric assays, we observe differences in the enzymatic activity of β-Galactosidase, which correlate well with the activity of the different HHRz variants in vitro and which can be unambiguously attributed to ribozyme cleavage by primer extension analysis. English
Place of Publication: Darmstadt
Uncontrolled Keywords: Hammerhead Ribozym, katalytische Aktivität, tertiäre Interaktionen
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Ribogenetics
Date Deposited: 13 May 2013 12:30
Last Modified: 07 May 2014 22:04
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-33709
Referees: Hammann, Prof. Dr. Christian and Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Refereed: 12 February 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3370
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