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Selektion und Charakterisierung von RNA-Aptameren zur Genregulation und Antibiotikatherapie

von Laer, Karl Ludwig :
Selektion und Charakterisierung von RNA-Aptameren zur Genregulation und Antibiotikatherapie.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2013)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Selektion und Charakterisierung von RNA-Aptameren zur Genregulation und Antibiotikatherapie
Language: German
Abstract:

RNA-Aptamere sind vielseitige Moleküle, die ein breites Spektrum von Liganden mit hoher Spezifität und Affinität binden, und die durch in vitro Selektion entwickelt werden. In dieser Arbeit werden die Möglichkeiten einer therapeutischen Anwendung von RNA-Aptameren als Antibiotika beschrieben. Nach jahrzehntelangem Einsatz von Antibiotika haben viele Bakterienstämme Resistenzen entwickelt, wodurch ein hoher Bedarf nach neuen Wirkstoffen besteht. Ein vor wenigen Jahren entdeckter Resistenzfaktor ist die Neu Dehli Metallo-β-Lactamase NDM1, die sich in kurzer Zeit über die ganze Welt verbreitet hat. NDM1 spaltet Carbapeneme, die als Breitbandantibiotika der letzten Reserve lange Zeit zurückgehalten wurden. Die Selektion gegen NDM1 führte zu einer spezifischen Anreicherung von bindenden RNA-Sequenzen, die Einzelsequenz D909 zeigte dabei die besten Bindungseigenschaften. Ein Bindemotiv im 5‘-Bereich von D909 konnte identifiziert werden. D909 inhibierte spezifisch NDM1 in einem nitrocefinbasierten Enzymaktivitätstest. Diese Studie zur RNA-basierten Inhibition von NDM1 legt den Grundstein für neue Therapieansätze zur Bekämpfung multiresistenter Bakterien. Den evolvierenden Krankheitserregern wird durch die in vitro Selektion eine evolutive Antibiotika-Entwicklung entgegengesetzt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden neue Genschalter für prokaryotische Systeme entwickelt. Natürliche RNA-Schalter wurden auf regulatorische Aktivität in Nicht-Wirtorganismen untersucht. Die Adeninschalter add aus Vibrio vulnificus und pbuE aus Bacillus subtilis konnten in ein Escherichia coli basiertes Reportersystem implementiert werden. Der 2’dG-abhängige mfl-Schalter aus Mesoplasma. florum wurde in E. coli und in B. subtilis eingesetzt. In B. subtilis wurde durch den mfl-Schalter eine 90%ige Repression der Reportergenaktivität erreicht. Dabei wurde die mfl-Aptamerdomäne in den xpt-Schalter integriert und so ein synthetischer RNA-Schalter aus natürlichen Komponenten entwickelt. Im Gegensatz dazu stand eine Variante von mfl, das künstliche hybrid-Aptamer. Dieses war in vitro bindungskompetent, besaß aber keine regulatorische Funktion in vivo. Am Beispiel der 2’dG-Aptamere konnte gezeigt werden, dass helikale Bereiche und Tertiärstrukturelemente der Purin-Aptamere zwar mutiert werden können, ohne die charakteristische Faltung oder Bindungskompetenz in vitro zu beeinflussen. Die biologische Funktion des Aptamers dagegen ist sensibel von der Nukleotidsequenz abhängig.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
New antibiotic therapy approaches are needed to keep step with fast evolving strains of bacteria. This study aims to the development of RNA aptamers as a new class of antibiotic substances. Aptamers are short RNA molecules, which bind protein targets with high specificity and affinity. The development of RNA aptamers is performed through an evolutionary in vitro selection process, termed SELEX. Aptamers were selected against β-lactamases, which are a major resistance factor against β-lactam antibiotics in Gram negative bacteria. As of late carbapenemases like the New Dehli metallo β-lactamase NDM1 are on the rise, that are able to destroy β-lactam antibiotics of the last resort. In this study, RNA based inhibitors of NDM1 were developed through SELEX, which can be used to resensitize multiresistent bacteria against carbapenems. The fast evolution of bacterial resistance factors is countered by employing the evolutionary in vitro selection for antibiotic research.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Postranscriptional Gene Regulation and RNA Therapeutics
Date Deposited: 12 Feb 2013 11:53
Last Modified: 12 Feb 2013 11:53
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-32967
Referees: Suess, Prof Beatrix and Goehringer, Prof H Ulrich
Refereed: 1 February 2013
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3296
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