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Charakterisierung der Phosphorylierung von c-Abl an Threonin735 in Helicobacter pylori-infizierten Epithelzellen

Schneider, Sabine :
Charakterisierung der Phosphorylierung von c-Abl an Threonin735 in Helicobacter pylori-infizierten Epithelzellen.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2012)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Charakterisierung der Phosphorylierung von c-Abl an Threonin735 in Helicobacter pylori-infizierten Epithelzellen
Language: German
Abstract:

Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein verbreitetes Humanpathogen, das die Magenschleimhaut von ca. 50% der Weltbevölkerung besiedelt. Ohne Eradikation des Bakteriums durch eine antimikrobielle Therapie persistiert es ein Leben lang. Eine Infektion mit H. pylori kann zu der Entstehung schwerwiegender Krankheiten wie Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren oder Magenkrebs führen. Die Entstehung solcher schwerwiegenden Krankheiten basiert auf dem Einfluss dieses Pathogens auf zelluläre Signalwege, die unter anderem eine vermehrte Zellmotilität, Zellproliferation oder eine Verschiebung des Gleichgewichts zwischen Apoptose und Proliferation der infizierten Zellen bewirken. Studien haben eine Steigerung der Migration H. pylori-infizierter Zellen durch eine Aktivierung der nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase c-Abl im Zytoplasma der Zellen gezeigt. C-Abl stellt ein zentrales Schalterprotein in der Regulierung von Apoptose und Zellmigration in Zellen dar, dessen Lokalisierung in der Zelle von entscheidender Bedeutung für seine Funktion ist. Eine Phosphorylierung von c-Abl an Threonin735 (c-AblT735) ermöglicht eine Bindung von c-Abl an dem zytoplasmatischen Bindeprotein 14-3-3 und verzögert bei einer Aktivierung der Tyrosin-Kinase dessen Translokation in den Zellkern und eine damit verbundene Induktion von Apoptose. In der hier vorgelegten Arbeit wurde der Einfluss von zytoplasmatischem c-Abl in H. pylori-infizierten gastralen Epithelzellen auf Apoptose und Zellmigration untersucht. Der Fokus lag auf dem Einfluss der Phosphorylierung von c-AblT735 auf diese H. pylori-induzierten Prozesse und der Identifizierung der c-AblT735-phosphorylierenden Threoninkinase in diesen Zellen. Eine H. pylori-induzierte Phosphorylierung von c-AblT735 wurde unter Verwendung eines anti-phospho-c-AblT735 Antikörpers im Western Blot in allen drei untersuchten epithelialen Zelllinien nachgewiesen. Die zelluläre Auswirkung in Bezug auf Apoptose, Zellviabilität und Zellmigration wurde in Zellen dokumentiert, die jeweils ein c-Abl-Wildtyp (c-Ablwt) Protein oder dessen phosphorylierungsresistente Mutante c-AblT735A über-exprimierten und mit H. pylori infiziert wurden. Laserskanmikroskopie zeigte, dass T735-phosphoryliertes c-Ablwt im Zytoplasma der H. pylori-infizierten Epithelzellen lokalisiert war, wohingegen die phosphorylierungsresistente c-AblT735A-Mutante vornehmlich im Zellkern nachgewiesen wurde. Eine FACS-Analyse von c-Ablwt- und c-AblT735A-exprimierenden Zellen wies nach H. pylori-Infektion deutlich mehr apoptotische Zellen in den c-AblT735A- als in den c-Ablwt-exprimierenden Zellen auf. Sechs Stunden nach Infektion der c-Ablwt-exprimierenden Zellen mit MOI 50 wiesen diese im Vergleich zu den kontrollinfizierten Zellen sogar 6% weniger apoptotische Zellen auf, wohingegen die c-AblT735A-exprimierenden Zellen 6% mehr apoptotische Zellen als deren Kontrolle aufwiesen. Eine H. pylori-Infektion der c-AblT735A-exprimierenden Zellen mit MOI 100 nach 24 Stunden, apoptotische Zellen c-Ablwt 26% c-AblT735A 45%, und MOI 10 nach 48 Stunden, apoptotische Zellen c-Ablwt 51% c-AblT735A 68%, zeigte den deutlichsten Unterschied in der Induktion von Apoptose zwischen c-Ablwt- und c-AblT735A-exprimierenden Zellen. Das Ergebnis des FACS Apoptose-Assays wurde anhand eines Zellviabilitäts-Assays bestätigt. In einem Zellmigrations-Assay wurde nach 24-stündiger H. pyolri-Infektion mit MOI 50 eine Erhöhung der Migration der c-Ablwt-exprimierenden Zellen um das 4,3fache im Vergleich zu den c-AblT735A-exprimierenden Zellen um das 2,5fache dokumentiert. Anhand der Apoptose-, Zellviabilitäts- und Zellmigrationsassays konnte erstmals eine antiapoptotische und promigratorische Funktion der H. pylori-induzierten T735-Phosphorylierung in infizierten Epithelzellen aufgezeigt werden. Ko-Immunpräzipitation von phosphoryliertem c-Abl mit dem zytoplasmatischen Bindeprotein 14-3-3 mit einem anti-c-Abl Antikörper und anschließender Detektion von 14-3-3 mit einem anti-14-3-3 Antikörper im Western Blot zeigte eine gesteigerte Interaktion beider Proteine nach Infektion gastraler Epithelzellen mit H. pylori. Auf bakterieller Ebene wurde eine Abhängigkeit der Phosphorylierung von dem Vorhandensein der cag-Pathogenitätsinsel (cagPAI), einem funktionellen T4SS und dem Adhäsin CagL mittels anti-phospho-c-AblT735 Antikörper im Western Blot nachgewiesen. Der Grad der induzierten Phosphorylierung war unabhängig von den bakteriellen Pathogenitätsfaktoren CagA und VacA. In vorangegangenen Studien war die zelluläre dual-spezifische Serin/Threonin-Thyrosin-Proteinkinase TTK als diejenige Kinase identifiziert worden, die c-Abl an T735 zu phosphorylieren vermag. Die Ergebnisse der in vitro Phosphorylierungsreaktion von c-Abl durch Proteinkinase C (PKC), der spezifische knock down von TTK und PKCs mittels siRNA und die Dokumentation der Aktivierung der PKC Isoformen α und β mittels spezifischer Antikörper gegen aktiviertes PKC α und β im Western Blot in dieser Arbeit deuten jedoch darauf hin, dass die H. pylori-induzierte Phosphorylierung auf einer gesteigerten Aktivität der Proteinkinase C Isoformen α und β der infizierten Zellen basiert. Aufgrund dieser Beobachtungen ist es naheliegend, dass eine Interaktion von bakteriellem CagL mit Integrinen der Wirtszelle zu einer Aktivierung der Serin/Threoninkinasen PKCα und PKCβ führt. Die daraus resultierende Phosphorylierung an c-AblT735 führt zu einer antiapoptotischen, prozellmigratorischen Reaktion der H. pylori-infizierten Zellen, basierend unter anderem auf einer Interaktion mit 14-3-3 und somit dem Zurückhalten von c-Abl im Zytoplasma der Zellen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Helicobacter pylori (H. pylori) colonizes the human gastric mucosa of more than 50% of the worlds` population and persists without antibacterial eradication a lifelong. The infection of the gastric mucosa with H. pylori can lead to the development of gastric or duodenal ulcers and even gastric cancer. This is based on the influence of H. pylori on cellular signaling processes leading to an increase of cell motility, cell proliferation or the displacing of the equilibrium of apoptosis and proliferation of the infected cells. Cellular studies have shown an increase of cell migration of H. pylori-infected cells based on the activation of the non-recetor tyrosine kinase c-Abl. C-Abl is a central cellular protein, which serves as a molecular switch between apoptosis and cell migration. Its sub cellular localization has a central impact on its cellular function. Phosphorylation of c-Abl on threonine735 (c-AblT735) leads to the binding of the cytoplasmic binding protein 14-3-3. The activation of c-Abl bound to 14-3-3 prevents the nuclear entry of c-Abl and the subsequent induction of apoptosis in these cells. In this study the influence of cellular c-Abl on apoptosis and cell proliferation in H. pylori-infected gastric epithelial cells was investigated. A special focus was set on the influence of the phosphorylation on c-AblT735 on H. pylori-induced apoptosis and cell proliferation and the identification of the kinase that phosphorylates c-Abl on threonineT735 in infected cells. The H. pylori-induced phosphorylation on c-AblT735 was shown in western blot analysis in three epithelial cell lines by using a specific anti-phospho-c-AblT735 antibody. The influence of the H. pylori-induced phosphorylation on c-AblT735 on apoptosis, cell viability and cell migration was investigated in cells stably or transiently expressing a c-Abl wild type protein (c-Ablwt) or its phosphorylation resistant c-AblT735A mutant protein infected with H. pylori. Laser scan microscopy revealed the localization of T735-phosphorylated c-Ablwt protein in the cytoplasm of the infected epithelial cells whereas the phosphorylation resistant c-AblT735A mutant protein was primarily localized in the nucleus of the H. pylori-infected cells. FACS analysis of c-Ablwt- or c-AblT735A-expressing cells displayed significantly more apoptotic cells in cells expressing the c-AblT735A protein than cells expressing the c-Ablwt protein after infection with H. pylori. Six hours post infection with H. pylori with moi 50 the c-Ablwt-expressing cells revealed even 6% less apoptotic cells compared to the control-infected cells whereas the H. pylori moi 50-infected cells expressing the c-AblT735A protein revealed 6% more apoptotic cells compared to the control-infected cells. The most significant difference in regards to the induction of apoptosis between c-Ablwt- and c-AblT735A-expressing cells was shown in cells infected with H. pylori with moi 100 for 24 hours, apoptotic cells c-Ablwt 26% and c-AblT735A 45% and with moi 10 for 48 hours, apoptotic cells c-Ablwt 51% and c-AblT735A 68%. The results of the FACS apoptosis assay were confirmed by performing a cell viability assay. A cell migration assay showed a 4,3fold increase of cell migration in c-Ablwt-expressing cells infected with H. pylori with moi 50 for 24 hours compared to c-AblT735A-expressing cells showing a 2,5fold increase of migrating cells post infection. Based on the results of the apoptosis, cell viability and cell migration assays it could be demonstrated for the first time that the H. pylori-induced phosphorylation on c-AblT735 exhibits an anti apoptotic and pro migratory effect in infected epithelial cells. Co-immunoprecipitation of phosphorylated c-AblT735 and the cytoplasmatic binding protein 14-3-3 was performed by using a specific anti-c-Abl antibody and displayed in western blot by using a specific anti-14-3-3 antibody. The infection of epithelial cells with H. pylori increased the interaction of c-Abl and 14-3-3 as shown by the co-immunoprecipitation of these two proteins. Western blot analysis of epithelial cells infected with different H. pylori mutant strains revealed that the H. pylori-induced phosphorylation of c-AblT735 is dependent on the presence of the bacterial cag-pathogenicity island (cagPAI), a functional T4SS and the adhesion protein CagL, but independent of bacterial CagA or VacA. In previous studies the cellular dual specific serine/threonine-tyrosine protein kinase TTK was identified as the kinase that phosphorylates c-Abl on T735. The results of in vitro phosphorylation of c-Abl by the protein kinase C (PKC), the specific knock down of TTK and PKCs via siRNA and western blot analysis of the activation of the PKC isoforms α and β using specific antibodies against activated PKC α and β indicated the dependence of the H. pylori-induced phosphorylation of c-Abl on an increased activity of PKC α and β of the infected cells. Based on these findings it is obvious that the interaction of bacterial CagL with integrins of host cells leads to the activation of the serine/threonine kinases PKCα and PKCβ and an increase of phosphorylated c-AblT735 of the infected cells. This subsequently results in an anti apoptotic and pro migratory effect of the infected cells which might be due to the increased interaction of c-Abl and 14-3-3 leading to the localization of c-Abl in the cytoplasm of the H. pylori-infected cells. English
Place of Publication: Darmstadt
Uncontrolled Keywords: Helicobacter pylori, c-Abl, gastric cancer, apoptosis, cell migration, cell viability
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
UNSPECIFIEDGerman
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: ?? fb10_mikrobiologie ??
Date Deposited: 22 Jan 2013 13:19
Last Modified: 22 Jan 2013 13:19
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-32558
Referees: Kletzin, PD Arnulf and Löwer, Prof. Dr. Johannes and Engstler, Prof. Dr. Markus
Refereed: 1 October 2012
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3255
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