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Enzymatic Properties and Directed Evolution of Transketolase and Chemoenzymatic Synthesis of neo-Sialoconjugates

Yi, Dong :
Enzymatic Properties and Directed Evolution of Transketolase and Chemoenzymatic Synthesis of neo-Sialoconjugates.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2012)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Enzymatic Properties and Directed Evolution of Transketolase and Chemoenzymatic Synthesis of neo-Sialoconjugates
Language: English
Abstract:

Transketolase (TK, EC 2.2.1.1) katalysiert den stereospezifischen Transfer einer C2- Ketoleinheit auf das Carbonylende einer Reihe von Aldehyden. Die Verwendung der TK zum Aufbau von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen erhält wegen der hoch stereoselektiven Bildung eines (S)-konfigurierten, chiralen Zentrums unter gleichzeitiger Racematspaltung von (2R)-Hydroxyaldehyden vermehrte Beachtung. Insbesondere beim Einsatz von Hydroxypyruvat (HPA) als Donor führt die Freisetzung von CO2 zu einer irreversiblen Reaktion wobei das freigesetzte Bicarbonat den pH-Wert des Reaktionssystems erhöht. Aufbauend auf diesem Prinzip wurde, mit HPA als Donor und Phenolrot als empfindlichem pH Indikator, eine neue, kontinuierliche pH-basierte Assaymethode für das Hochdurchsatzscreening der TK entwickelt. Dieser generische Assay kann zuverlässig für die Colorimetrische Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität und zur Messung kinetischer Konstanten benutzt werden. Mit dieser Methode wurden sowohl die kinetischen Konstanten und die Akzeptoraffinitäten der TK aus Escherichia coli (TKeco) und Saccharomyces cerevisiae (TKyst) als auch zweier TKeco-Mutanten, (TKD469E eco und TKH26Y eco), für einen detailierten Vergleich untereinander ermittelt. Die quantitativen Daten zeigen, dass das katalytische Potenzial von Wildtyp-TKeco und TKyst sehr ähnlich sind und nur eine geringe Variation aufweisen. Wildtyp-TK-Enzyme haben eine hohe Präferenz für α-hydroxylierte Akzeptoren, zusammen mit einer ausgeprägten Stereoselektivität gegenüber der (2R)-Konfiguration. Die Variante TKD469E eco zeigt signifikant höhere Aktivität gegenüber 2-deoxygenierten Aldehyden als das entsprechende Wildtyp Enzym. Die TK aus Geobacillus stearothermophilus (TKgst) ist ein neues Enzym, das kürzlich kloniert wurde und eine beeindruckende Thermostabilität aufweist. Ähnlich wie andere TKs zeigt es eine geringe Aktivität bei nicht α-hydroxylierten Aldehyden. Um diese Aktivität zu erhöhen wurden in einem ersten Versuch Sättigungsmutagenesebibliotheken der TKgst an den Positionen Leu382 und Asp470 erstellt. Leu382 and Asp470 sind die entsprechenden Aminosäurereste zur Bindung der Hydroxymethylen-Gruppe von α-hydroxylierten Aldehyden. Das Screening der Bibliothek lieferte mehrere positive Varianten, sowohl aus der einfach, als auch aus der doppelt mutierten Bibliothek. Als herausragende Mutante konnte die Variante Asp469Ile mit einer 17-, 13- und 8.6-fachen Aktivitätsverbesserung im Vergleich zum Wildtyp-Enzym gegenüber Propanal, Butanal and Methoxyethanal identifiziert werden. Ihre hohe Thermostabilität mit einer Tm von 74 °C bleibt erhalten. Sialinsäuren sind Kohlenhydrat-Derivate bestehend aus neun Kohlenstoffatomen die eine Carboxylaruppe besitzen. Sie kommen weit verbreitet frei oder konjungiert an Glycanen der Zelloberfläche von und erfüllen dort wichitge Funktionen in der Zellphysiologie. Deshalb ist es wichtig, Methoden für die Synthese spezifisch sialokonjugierter Epitope in vitro zu entwickeln, um die Forschung von Kohlenydrat-Protein-Interaktionen in physiologischen Prozessen zu ermöglichen. Sialinsäurereste werden von α/β-Galactosyl-α-2,3/2,6-Sialyltransferasen auf die terminale Galactoseeinheit von Oligosacchariden übertragen. Deshalb stellen diese nützliche Werkzeuge für die Synthese von Sialokonjugaten in vitro dar. Zu diesem Zweck wurden α-2,3- und 2,6-Sialyltransferasen aus Photobacterium phosphoreum (2,3SiaTpph) und entsprechend aus Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-145 (2,6SiaTple) kloniert. Um die Substratspezifität dieser beiden SiaTs zu untersuchen, wurde zur Bestimmung der kinetischen Konstanten und der Substrattoleranz ein pH-basierter Assay etabliert, in dem Phenolrot als pH-Indikator in schwach gepuffertem Medium dient. Diese pH-Assay-Methode ist schnell, empfindlich und kontinuierlich und konnte zur Bestimmung der kinetischen Konstanten und der Substrattoleranz von 2,3SiaTpph und 2,6SiaTple herangezogen werden. Diese beiden SiaTs weisen eine deutlich unterschiedliche Akzeptorspezifität auf. Während die 2,3SiaTpph α- und β-Galactoside, Lactoside, Glc, Man und GalNAc gut akzeptieren kann, zeigt die 2,6SiaTple nur gegenüber β-Galactosiden und Lactosiden eine hohe Aktivität. Durch den Strukturabgleich zwischen 2,3SiaTpph and 2,6SiaTple wurde Trp347 als Ursache für die Blockade des aktiven Zentrums für α-Galactoside identifiziert. Um die Aktivität der 2,6SiaTple bezüglich α-Galactosiden zu verbessern wurden drei Mutagenesebibliotheken erstellt. Hierfür wurde die Hochdurchsatz-Screeningmethode mit Methyl-α-D-galactopyranosid als Akzeptor verwendet. Es konnte jedoch keine positive Variante identifiziert werden, was zeigt, dass Trp347 in der 2,6SiaTple offenbar nicht problemlos ersetzbar ist. Es ist zu vermuten, dass Trp347 zur Bindung zwischen Donor und Akzeptor beiträgt und die korrekte Akzeptor-Konformation für die Bildung von 2,6-sialisierten Produkten stabilisiert. Die CMP-Sialinsäure-Synthetase (CSS, E.C. 2.7.7.43) katalysiert die CMP-Aktivierung von Sialinsäuren unter Verwendung von CTP als Donor und Mg2+ als Cofaktor. Es konnte gezeigt werden, dass eine Reihe von Neu5Ac-Analogen mit einer sterisch auspruchsvollen Modifikation an der Acylamino-Gruppe von CSS aus Neisseria meningitidis (CSSnme) akzeptiert werden können, obwohl ihre korrespondierenden kcat/KM Werte viel niedriger sind als diejenigen des natürlichen Substrates Neu5Ac. Durch ein Alignment des aktiven Zentrums für die Akzeptorbindung der CSSnme wurden Phe192 und Phe193 als die entsprecheuden Reste für die Bindung der Acylaminogruppe in Neu5Ac identifiziert. Darauf aufbauend wurden vier Sättigungsmutagenesebibliotheken an den Positionen Phe192 und Phe193 konstruiert, um die Aktivität gegen Neu5Ac-OBz, Neu5Hex und Neu5PenN3 zu verbessern. Aus dem Screening mit der pH-basierten Hochdurchsatzmethode ergaben sich CSSnme-Phe192Cys/Phe193Tyr, CSSnme-Phe192Ser, und CSSnme-Phe192Ser/Phe193Tyr als die besten Kandidaten mit jeweils 14.1-, 4.6- und 4.0-facher Aktivitätssteigerung gegen Neu5Ac-OBz, Neu5Hex und Neu5PenN3. Um die verbesserte Aktivität zu validieren, wurden diese drei CSS-Varianten zusammen mit der 2,6SiaTple für eine präparative Synthese von neuen Neo-Sialokonjugaten verwendet. Die Ausbeuten der Endprodukte betrugen 50%, 64% bzw. 70%. Oligosacharide mit einer endständigen N-Acetyl-D-lactosamin Einheite (LacNAc) sind ein wichtiges natürliches Substrat der SiaTs. Die Synthese von LacNAc und seiner Derivate in vitro erweitert daher die Akzeptor Vielfalt für die Herstellung von Neo-Sialokonjugaten. Für diesen Zureck wurden die β-1,4-Galactosyltransferase aus Helicobacter pylori (GalThpy) und die UDP-Galactose-4-Epimerase aus E. Coli (GalEeco) kloniert und in einem E. coli-Expressionssystem exprimiert. Mit Hilfe dieser beiden rekombinanten Enzyme wurden freies LacNAc und LacNAc-D-T-P-Acr aus UDP-Glc als Donor sowie den entsprechenden Akzeptorsubstraten in isolierten Ausbeuten von 88%, 92% und 85% jeweils im 100 mg-Maßstab für weitere präparative Zwecke synthetisiert. Unter Verwendung der 2,3SiaTpph bzw. 2,6SiaTple sowie der neuen CSS-Varianten wurden die Neo-2,3- und 2,6-Sialokonjugate in einer Eintopf-Reaktion mit zwei Enzymen synthetisiert. Sechs typische Sialinsäuren (Neu5Ac, Neu5Gc, Kdn, epi-Kdn, Neu5Ac-9-N3 und Neu5NPhAc) mit Modifikationen an C5 und C9 wurden als Donoren an fluoreszente Lactose (Lac-D-T-P-Acr) und N-Acetyl-D-lactosamin (LacNAc-D-T-P-Acr) mit α-2,3- and α-2,6-Konfiguration gekuppelt. Die 2,3SiaTpph und 2,6SiaTple zeigen sehr ähnliche Donorspezifitäten gegen über diesen sechs Sialinsäuren. Beide akzeptieren Neu5Ac, Neu5Gc, Kdn und Neu5Ac-9-N3 gut, reagieren jedoch mit dem sterisch auspruchsvollen Neu5NPhAc schlechter. Darüber hinaus kann die 2,6SiaTple das epi-Kdn besser als die 2,3SiaTpph akzeptieren. Kürzlich wurde eine neue potentielle Sialyltransferase aus Shewanella piezotolerans (SiaTspi) beruhend auf der genomischen DNA-Sequenz von S. piezotolerans beschrieben. Über eine Klonierung, Expression und einen Aktivitätstest der SiaTspi liegen jedoch noch keine Berichte vor. Deshalb wurde das künstliche Gen im Rahmen dieser Arbeit kloniert, modifiziert und optimal im E. coli und Yarrowia-Expressionssystem exprimiert. Der Sequenz-BLAST und die strukturelle Übereinstimmung mit anderen 2,3SiaT-Sequenzen innerhalb der CAZy-Familie GT80 ließen eine funktionelle upstream-Sequenz erkennen. Die Deletion eines Loops mit 12 Aminosäurenresten verbesserte die Identifizierung der 2,3-SiaT-Aktivität durch eine Reaktion mit fluoreszenzmarkiertem Akzeptor, insbesondere bei Koexpression mit Chaperonen. Die geringe Expression an löslichem Protein sowohl im E. coli-, als auch im Y. lipolytica-Expressionssystem vereitelte jedoch eine weitergehende Charakterisieng des Enzymes.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Transketolase (TK; EC 2.2.1.1) catalyzes the stereospecific transfer of a two carbon ketol unit to the carbonyl terminus of a variety of aldehydes. The use of TK for carbon-carbon bond formation is receiving increased attention for asymmetric synthesis because of the highly stereocontrolled formation of an (S)-configurated chiral center with efficient concomitant chiral resolution for (2R)-hydroxyaldehydes. Especially when using hydroxypyruvate (HPA) as donor, the release of CO2 makes the synthetic reaction irreversible, and the released bicarbonate increases the pH of the reaction system. According to this principle, a novel continuous pH-based assay method has been developed for the high-throughput screening of TK, in the presence of HPA as donor and phenol red as a sensitive pH indicator. The assay is generic and can be used for the reliable colorimetric determination of specific enzyme activity and measurement of kinetic constants. Based on this method, the kinetic constants and acceptor specificity of TK from Escherichia coli (TKeco) and Saccharomyces cerevisiae (TKyst), as well as two TKeco variants (TKD469E eco and TKH26Y eco), have been determined for a detailed comparison of the enzymes. From the quantitative data, the catalytic capabilities of wild-type TKeco and TKsce are quite similar with only very little variation. Wild-type TK enzymes have a strong preference for α-hydroxylated acceptors with strict stereoselectivity towards the (2R)-configuration. The variant TKD469E eco shows significantly higher activities towards 2-deoxygenated aldehydes than the corresponding wild-type enzyme. The TK from Geobacillus stearothermophilus (TKgst) is a novel enzyme which has been cloned and identified recently to have an impressively high thermostability. Similar to other TKs, it also shows low activity towards non-α-hydroxylated aldehydes. In order to improve its activity, saturation mutagenesis libraries of TKgst at Leu382 and Asp470 have been constructed in a first attempt to improve activity towards aliphatic aldehydes; Leu382 and Asp470 are the corresponding residues for binding of the hydroxymethylene group of α-hydroxylated aldehydes. Library screening revealed several positive variants from both single-site libraries and the double-site library. Asp469Ile was identified as the top mutant with 17, 13 and 8.6 fold activity improvement towards propanal, butanal and methoxyethanal, respectively, in comparison to the wild-type, but the protein still maintains high thermostability with a Tm of 74 °C. Sialic acids are a family of 9-carbon sugars which exist broadly at the termini of free or conjugated glycans on the surface of cells, playing significant roles in cell physiology. Therefore, it is significant to develop methods for the synthesis of specific sialoconjugate epitopes in vitro to facilitate research on carbohydrate-protein interactions in physiological events. α/β-Galactosyl α-2,3/2,6-sialyltransferases transfer sialic acid residues to the terminal galactose moiety of an oligosaccharide, and therefore becomes are useful enzymatic tools to synthesize sialoconjugates in vitro. For this purpose, bacterial α-2,3- and 2,6- sialyltransferases have been cloned from Photobacterium phosphoreum (2,3SiaTpph) and Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-145 (2,6SiaTple), respectively. In order to understand the substrate specificity of these two SiaTs, a pH-based assay method was established to determine the kinetic constants and substrate tolerance of SiaT. This assay method using a low concentration buffer system, and phenol red as pH indicator, is rapid, sensitive and continuous. Using this method, the kinetic constants and substrate tolerance of 2,3SiaTpph and 2,6SiaTple has been determined. These two SiaTs have quite different acceptor specificity. 2,3SiaTpph can well accept α- and β-galactosides, lactosides, Glc, Man and GalNAc. However, 2,6SiaTple has high activity only towards β-galactosides and lactosides. From the structure alignment between 2,3SiaTpph and 2,6SiaTple, Trp347 was found to be the responsible residue that is blocking the entrance to the active center for α-galactosides. Therefore, three mutagenesis libraries were constructed to improve 2,6SiaTple’s activity towards α-galactosides using the optimized pH-based assay as high-throughput screening method and methyl-α-D-galactopyranoside as acceptor. However, no positive mutant could be ifentified from the screening, which revealed that Trp347 cannot be simply substituted in 2,6SiaTple. It is speculated that Trp347 contributes to the binding between donor and acceptor and helps to stabilize the correct acceptor conformation to form the 2,6-sialated product. CMP-sialic acid synthetase (CSS, E.C. 2.7.7.43) catalyzes the CMP activation of sialic acid using CTP as donor and Mg2+ as cofactor. A series of Neu5Ac analogues with bulky modification on the acylamino group were showen to be accepted by CSS from Neisseria meningitidis (CSSnme), although their corresponding kcat/KM values were much lower than that of the natural substrate Neu5Ac. From an active site alignment for the acceptor binding of CSSnme, Phe192 and Phe193 were identified as the corresponding residues for binding of the acylamino group in Neu5Ac. Therefore, four saturation mutagenesis libraries were constructed on positions of Phe192 and Phe193 to improve its activity towards bulky analogs Neu5Ac-OBz, Neu5Hex and Neu5PenN3. From a screening by a pH-based high-throughput screening method, CSSnme-F192C/F193Y, CSSnme-F192S, and CSSnme-F192S/F193Y were the top enzyme variants with 14.1 fold, 4.6 fold and 4.0 fold activity improvements towards Neu5Ac-OBz, Neu5Hex and Neu5PenN3, respectively. In order to validate the improved activity, the in situ CMP activation of the Neu5Ac analogues was applied by using these CSS variants in with 2,6SiaTple a preparative synthesis of new neo-sialoconjugates. The yields of the final products were 50%, 64% and 70%, repectively. The N-acetyl-D-lactosamine (LacNAc) moiety at the terminus of oligosaccharides is an important natural substrate of SiaT. Synthesis of LacNAc and its derivatives in vitro can extend the diversity of acceptors for the synthesis of neo-sialoconjugates. For this purpose, β-1,4-galactosyltransferase from Helicobacter pylori (GalThpy) and UDP-galactose 4-epimerase from E. coli (GalEeco) were cloned and over-expressed in an E. coli expression system. Using these two recombinant enzymes, free LacNAc and LacNAc-D-T-P-Acr, as well as Lac-D-T-P-Acr were synthesized from UDP-Glc donor and the corresponding acceptor substrates, with isolated yields of 88%, 92% and 85%, respectively, on a 100 mg scale each for further preparative utilization. Using 2,3SiaTpph and 2,6SiaTple, as well as novel CSSnme variants, the neo-2,3- and 2,6-sialoconjugates were synthesized in a one-pot two-enzyme approach. Six typical sialic acids (Neu5Ac, Neu5Gc, KDN, epi-KDN, Neu5Ac-9-N3 and Neu5NPhAc) with modifications on C5 and C9 were involved as donors for enzymatic coupling to fluorescent lactose (Lac-D-T-P-Acr) and N-acetyl-D-lactosamine (LacNAc-D-T-P-Acr) acceptors with α-2,3- and α-2,6-configuration, respectively. 2,3SiaTpph and 2,6SiaTple show quite similar donor specificity towards these six sialic acids. Both of them can well accept Neu5Ac, Neu5Gc, KDN and Neu5Ac-9-N3, but are less reactive with the bulky Neu5NPhAc substrate analog. Moreover, 2,6SiaTple can accept epi-KDN better than 2,3SiaTpph. Recently, a novel potential sialyltransferase from Shewanella piezotolerans (SiaTspi) has been identified from the genomic S. piezotolerans sequence. However, cloning, expression and activity assay of SiaTspi have not been reported yet. Therefore, the artificial gene of this protein was cloned, modified and optimally expressed in the E. coli and a Yarrowia expression system. Its sequence BLAST and structure alignment with other 2,3SiaTs in CAZy GT80 family retrieved its functional upstream sequence. The deletion of a loop containing 12 amino acid residues also facilitated to identify its 2,3SiaT activity by using a reaction with fluorescent labeled acceptor, particularly when co-expressed with chaperonins. However, its low soluble expression in both E. coli and Y. lipolytica expression systems prevented its further characterization.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie
Date Deposited: 07 Jan 2013 11:03
Last Modified: 07 Jan 2013 11:03
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-32368
Referees: Fessner, Prof. Dr. Wolf-Dieter and Schmitz, Prof. Dr. Katja and Clapes, Prof. Dr. Pere
Refereed: 20 December 2012
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3236
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