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Strukturelle Organisation der DNA in PBCV-1

Wulfmeyer, Timo :
Strukturelle Organisation der DNA in PBCV-1.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2012)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Strukturelle Organisation der DNA in PBCV-1
Language: German
Abstract:

Der Prozess der DNA-Kondensation stellt in allen lebenden Organismen einen komplizierten Prozess dar. Der Größenunterschied zwischen DNA-Molekül und Zelle bzw. Viruskapsid, sowie die negative Ladung des Phosphatrückgrates der DNA sind die größte Schwierigkeit einer erfolgreichen DNA-Aggregation.

Im Laufe der Evolution haben sich unterschiedliche Prozesse entwickelt, um diese Aufgabe erfolgreich durchzuführen. So kodieren z.B. eukaryotische Zellen für Proteine, so genannte Histone, die wie in einer Spule von der DNA eng umschlungen werden. Dadurch ist es möglich die DNA zu kondensieren und eng zu packen. Dieser Prozess kann ebenfalls von positiv geladenen Molekülen, Polyaminen oder Kationen durchgeführt werden. Ebenso wurden Prozesse etabliert, die es ermöglichen Geninformation auf geringem Raum zu kodieren, die so genannten overlapping genes, um die Größe des Genoms zu reduzieren. Chlorellaviren sind ein positives Beispiel für eine erfolgreiche DNA-Kondensation wie am Prototyp dieser Familie, PBCV-1 zu erkennen ist. Die Herausforderung für diese Virengruppe besteht darin, ein Genom in ihrem Kapisd zu verpacken, welches 1000 mal länger ist.

In topographischen Atomic force microscopy - und fluoreszenzmikroskopischen Messungen wurde festgestellt, dass die isolierte, virale DNA repetitive Strukturen aufweist. Des Weiteren zeigen Sequenzanalysen, dass eine periodische Verteilung GC-reicher Sequenzen vorliegt, die mögliche Bindungsstellen für basische Proteine sein können. Biochemische Experimente zeigen, dass keine signifikanten Konzentrationen an Polyaminen vorliegen und diese Menge lediglich 0.02 % der DNA kondensieren könnte. Ebenso liegt keine höhere Konzentration eines einzelnen Kations, z.B. Mg2+, vor, wie Energy dispersive X-ray spectroscopy und Inductively coupled plasma-mass spectrometry belegen. Es ist allerdings möglich, dass die Summe aller Kationen für die Kondensierung teilweise verantwortlich ist, da bereits 58 % der DNA neutralisiert werden könnte. Diese Erkenntnis steht im Gegensatz zu den Ergebnissen der Phage λ, die ausschließlich Kationen und Polyamine zur Aggregation nutzt.

PBCV-1 kodiert für ein Protein, A278L, welches Kinaseaktivität aufweist. Des Weiteren ähnelt A278L in den physikalischen Eigenschaften Histonen und ist somit ein wichtiger Kandidat für die Aggregation der viralen DNA. Das rekombinante Protein zeigt in topographischen AFM-Messungen, im Vergleich zum neutralen Protein BSA, eine Verdopplung der Aggregation der viralen DNA.

Kraftspektroskopische Messungen zeigen, dass das rekombinante Protein A278L (25 nN) eine ähnliche Bindungskraft zur DNA aufweist wie die an der DNA assoziierten Partikel (64 nN). Dieses Protein könnte, neben Kationen, für das Aggregieren der DNA verantwortlich sein, so dass eine Metastruktur und eine Organisation der viralen DNA gewährleistet werden kann.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
DNA condensation is in all living organisms a difficult process due to the large size of a genome, in which as much genetic information as possible has to be packaged into a small volume. Frequently, the storing compartment has a diameter, which is thousand times smaller than the length of the DNA molecule. Evolution has solved this problem in different ways. Overlapping genes in viruses are able to increase the genomic information without compromising the size of the DNA molecule. In other viruses positively charged molecules and cations guarantee a neutralization of the DNA polymer and hence dense packaging. In higher organisms proteins are employed in tightly packaging DNA aggregates. An interesting example for successful condensation and packaging of a long dsDNA genome in a small volume is presented by the Chlorella viruses. In the case of virus PBCV-1 (Paramecium bursaria Chlorella virus-1), the prototype of Chlorella viruses, a ca. 100 µm long DNA molecule is packaged into a volume of only 1.7 * 10-7 m3. The small amounts of polyamines, which are present in the viral particle, are insufficient for charge compensation. To test whether virus PBCV-1 uses, like phages, cations for charge compensation, we measured the content of cations in the virus particles with Energy dispersive X-ray spectroscopy and Inductively coupled plasma-mass spectrometry. The data reveal that cations can be detected, but the concentration in the particle is not sufficient to accomplish the whole neutralization of the DNA molecule; only one fifth of the total phosphor concentration can be neutralized by Mg2+ or K+ or Ca2+. By summing up all cations, detected in the particle, we can estimate, that 58 % of the total phosphate can be neutralized in this way. Imaging of ejected viral DNA indicates that it is intimately associated with proteins in a periodic fashion. A combination of fluorescence images of ejected DNA and a bioinformatics analysis of the DNA reveal periodic patterns in the viral DNA. The periodic distribution of GC rich regions in the genome provides potential binding sites for basic proteins. Collectively the data indicate that the large Chlorella viruses have a DNA packaging strategy that differs from that of bacteriophages; it involves proteins and shares similarities to that of chromatin structure in eukaryotes. In the genome of PBCV-1 an ORF, A278L, encodes for a protein, with kinase activity, which resembles in its physical properties, i.e. small size and basic isoelectric point (IP: 10.8), histones. Further, the protein is present with a high copy number (397) in the virus particle. Altogether, this makes the gene product of A278L an interesting candidate for DNA condensation. We find in a qualitatively way that the recombinantly produced and purified protein A278L indeed causes a higher degree of genomic condensation. In comparison with the neutral protein BSA, A278L causes a roughly two fold higher degree of DNA clustering. Atomic force microscopy force spectroscopy was used to determine the DNA binding capacity of the A278L protein. An analysis of binding of native viral proteins, which were in contact with the viral DNA after a release by osmotical shock from the PBCV-1 virions, revealed a characteristic binding behaviour. The data revealed an average force of 64 ± 23 nN for the binding between native proteins and viral DNA. The recombinant protein A278L showed a similar binding strength to isolated viral DNA; on average 22 ± 3 nN were required to separate the protein from the DNA. These measured forces for separating proteins from DNA are specific for a protein/DNA interaction because proteins could be pulled away from the mica surface with a 100 times smaller force. The results of these experiments imply that virus PBCV-1 employs small molecules such as cations and polymaines in combination with proteins for packaging its large dsDNA genome in the virus particle. The proteins may support the organization of meta-structures and the consequent achievement of a crystalline-like order inside the virion. In addition, they may also provide substantial contribution to the neutralization of the DNA. The present results provide some new understanding of viral DNA packaging. This may help to create artificial devices for DNA shuttles in the field of gene therapy.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 20 Dec 2012 10:43
Last Modified: 20 Dec 2012 10:43
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-31999
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Refereed: 26 November 2012
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3199
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