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Biologische Bekämpfung des Falschen Mehltaus an der Gurke (Pseudoperonospora cubensis), Wirkung und Wirkweise von Aneurinibacillus migulanus und Federmohn-Extrakt

Schuster, Christina :
Biologische Bekämpfung des Falschen Mehltaus an der Gurke (Pseudoperonospora cubensis), Wirkung und Wirkweise von Aneurinibacillus migulanus und Federmohn-Extrakt.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2012)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Biologische Bekämpfung des Falschen Mehltaus an der Gurke (Pseudoperonospora cubensis), Wirkung und Wirkweise von Aneurinibacillus migulanus und Federmohn-Extrakt
Language: German
Abstract:

Mikroorganismen und aus Pflanzen gewonnene Naturstoffe können zur Bekämpfung von Phytopathogenen genutzt werden. In der Literatur lassen sich zahlreiche Beispiele dafür finden. Ziel der Arbeit war es, die Bakterienkultur aus Aneurinibacillus migulanus und einen Pflanzenextrakt aus Federmohn (Macleaya cordata) auf ihre Wirksamkeit gegen den Falschen Mehltau an Gurke verursacht durch Pseudoperonospora cubensis und die bestehenden Wirkmechanismen hin zu untersuchen. Zusätzlich sollten weitere Phytopathogene identifiziert werden, gegen die der Federmohnextrakt wirksam ist. Für die Bakterienkultur wurde die Möglichkeit der Kultivierung auf festem Medium überprüft. Es wurden außerdem vergleichende Untersuchungen verschiedener Phänotypen von A. migulanus durchgeführt.

Der Extrakt aus M. cordata wurde von der Firma Phytobiotics GmbH in einem speziellen Verfahren hergestellt. Dieses Verfahren enthielt auch die Aufkonzentrierung der wirksamen Substanz (Sanguinarin) auf durchschnittlich 60 %. Daher waren nur sehr geringe Mengen nötig, um einen hohen Wirkungsgrad gegen P. cubensis an Gurkenpflanzen im Biotest (Klimaraum) zu erzielen. Schon 40 – 50 µg/ml Extrakt waren ausreichend, um den Befall bei protektiver Anwendung um 90 % zu reduzieren. Mit der Flüssigkultur von A. migulanus ließ sich in dreifacher Verdünnung eine sehr gute protektive Wirkung von ca. 90 % erreichen. Diese Verdünnung entsprach ca. 200 µg/ml Gramicidin S, welches als Metabolit vom Bakterium gebildet wird und dem die hauptsächliche Wirkung zugeschrieben wird. Neben diesem Metaboliten gibt A. migulanus auch eine als Bionetzmittel wirkende Substanz in das Kulturmedium ab. Sie bewirkt, dass die Oberflächenspannung von Wasser gesenkt wird und die Pflanzen nach dem Benetzen schneller abtrocknen. Gurkenpflanzen, die mit der Kultur des A. migulanus E1-Stammes (bildet kein Gramicidin S) behandelt wurden, waren im Gegensatz zu den wasserbehandelten Pflanzen schon nach 30 min vollständig abgetrocknet. Dieser Abtrocknungseffekt bewirkte eine Verringerung des Befalls um ca. 71 % gegenüber der Kontrolle mit der selben Abtrocknungsdauer. Die Mischung des Extraktes aus M. cordata (50 µg/ml) und der Kulturbrühe von A. migulanus (1:5) führte zu einer nicht signifikanten Verbesserung der Wirkung der Mischungspartner. Von den Hauptwirkstoffen beider Präparate (Sanguinarin und Gramicidin S) sind zahlreiche direkte Wirkungen gegen Bakterien und Pilze beschrieben worden. In den eigenen Versuchen verringerten der Pflanzenextrakt sowie die Bakterienkultur den Schlupf und das Überleben der Zoosporen von P. infestans unter in vitro Bedingungen. In einem entsprechenden Versuch auf Blattscheiben bildeten geschlüpfte und enzystierte Zoosporen von P. cubensis nur wenige oder keine Keimschläuche aus. Auch das Myzelwachstum des auf Medium kultivierbaren Oomyceten P. infestans wurde durch Gramicidin S und den Pflanzenextrakt gehemmt. Neben der direkten Wirkung auf das Pathogen kann ein Präparat auch durch eine Induktion einer Resistenz in der Pflanze wirken. Mit Untersuchungen dazu wurde begonnen. Durch DAB-Färbung wurde eine erhöhte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies nachgewiesen, die vor allem nach Behandlung von ausgestanzten Blattscheiben mit dem Überstand der Kultur von A. migulanus wie auch mit dem Pflanzenextrakt beobachtet wurde. Wurden die Blattscheiben mit gewaschenen Bakterienzellen oder dem Metaboliten Gramicidin S behandelt, trat keine starke Reaktion auf. Die Expression von an Stressantworten beteiligten Enzymen mittels quantitativer Real-Time PCR zeigte eine starke Steigerung von Peroxidase kodierenden Genen (POD). Bei Pathogenesis Related Protein-1 kodierenden Genen (PR-1), wurde nur ein leichter Anstieg verglichen mit der Kontrolle beobachtet. Obwohl die Ergebnisse die direkte Wirkung der Präparate eindeutig belegen, kann die Resistenzinduktion nicht völlig ausgeschlossen werden. Hierzu sind weitere Untersuchungen notwendig.

Durch mehrfache Kultivierung der Bakterienkultur in flüssigem TSB-Medium kam es zur Aufspaltung in verschiedene Phänotypen. Es wurde ein Stamm A. migulanus weiß isoliert, der dem Wildtyp in Kolonieform, Sporenbildung und Metabolitenproduktion sehr ähnlich war. Ein weiterer Stamm mit untypischer Morphologie fiel auf, dessen Kolonien durchscheinend waren. Er bildete insgesamt weniger Zellen und keine Sporen, war jedoch in der Lage Gramicidin S zu produzieren. Durch phylogenetische Analyse der 16S rRNA kodierenden Gene wurden beide Stämme dem A. migulanus-Typenstamm (DSM 2895T) zugeordnet, was durch Sequenzähnlichkeiten von 99,9 – 99,7 % in der p-Abstandsmatrix unterstützt wurde.

Für die Anwendung in der Praxis werden große Mengen der Kulturbrühe von A. migulanus benötigt. Vorangegangene Untersuchungen zur Kultivierung ergaben jedoch, dass es bisher schwierig ist, das Bakterium im Flüssigfermenter (7 L) zu fermentieren. Das Problem bestand darin, dass A. migulanus hier zwar Sporen bildete, aber nur sehr wenig Gramicidin S produzierte. In eigenen Versuchen war die Kultivierung auf festem Medium dagegen problemlos möglich und es konnten vergleichbare Gramicidin S-Ausbeuten wie bei der Kultivierung im 1 L-Erlenmeyerkolben (200 ml TSB) erzielt werden. Der Nachteil dieser Kultivierungsmethode bestand jedoch darin, dass kein Bionetzmittel „geerntet“ werden konnte, da dieses entweder nicht gebildet wurde oder in das Nährmedium hinein diffundierte. Die Wirkung dieser Präparate beruht demgemäß ausschließlich auf dem produzierten Metaboliten.

Der Extrakt aus M. cordata wird in Deutschland als Zusatzstoff für Tierfutter verkauft (Phytobiotics GmbH) und es ist wenig über das Wirkspektrum gegen Phytopathogene bekannt. Neben der sehr guten Wirkung gegen Falschen Mehltau-Pilze konnte keine Wirkung gegen den Erreger des Echten Gurkenmehltaus (Podosphaera xanthii) gefunden werden. Es zeigte sich jedoch, dass in hohen Konzentrationen von 1000 µg/ml eine Wirkung gegen Möhrenschwärze (Alternaria dauci und A. radicina) an Möhrensaatgut besteht. Daher ist der Einsatz als Saatgutbeizmittel denkbar. In in vitro Versuchen auf Nährmedium wurden die Pilze Botrytis cinerea, Fusarium graminearum und Phytophthora infestans durch Konzentrationen von 20 - 50 µg/ ml im Wachstum gehemmt. Die Ergebnisse aus diesen Versuchen bieten Anhaltspunkte für das Wirkspektrum des Extraktes aus M. cordata. Versuche an ganzen Pflanzen unter kontrollierten und unter Praxisbedingungen sollten folgen, um diese Ergebnisse zu verifizieren.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Numerous examples can be found in literature for the use of microorganisms and natural products from plants as control agents against phytopathogens. It was the aim of the present doctoral thesis to study the efficacy and mode of action of both a bacterial culture of Aneurinibacillus migulanus and a plant extract of plume poppy (Macleaya cordata) against downy mildew on cucumber caused by the oomycete fungus, Pseudoperonospora cubensis. With the plant extract, additional investigations of effects against further phytopathogens were performed. For the bacterial culture, growth was tested on solid medium in addition to liquid cultivation. Furthermore, comparative investigations with different phenotypes of A. migulanus were undertaken. The plant extract from M. cordata is produced by Phytobiotics GmbH using an optimized process including the upgrading of the active ingredient (Sanguinarin) to about 60%. At low concentrations of 40 - 50µg/ml, the upgraded extract gave rise to a 90% reduction of the infestation of cucumber with P. cubensis in bioassays after protective treatment. With a threefold diluted liquid culture of A. migulanus, a very good efficacy of about 90% could be reached when applied protectively. This dilution corresponded to about 200µg/ml gramicidin S, an antimicrobially active metabolite produced by A. migulanus. Together with the metabolite a biosurfactant is produced by the bacterium and released into the culture broth. The surfactant reduces surface tension of water and leads to a faster drying of plants after wetting. The treatment of cucumber plants with a culture of A. migulanus mutant E1 (no production of gramicidin S) causes a faster drying of the leaves. After 30 min plants were completely dry in contrast to water treated plants. This effect led to a reduction of the infestation of about 71% as compared to the water control after the same time of drying. Combination of the extract of M. cordata (50µg/ml) and the bacterial preparation of A. migulanus (1:5) resulted in a non-significant improvement over the efficacy of both single preparations. For both active substances (sanguinarin and gramicidin S) of the investigated preparations, direct effects against bacteria and fungi were described previously. In our own trials the plant extract and the bacterial preparation reduced the release and the survival of zoospores of the in vitro cultivable oomycete Phytophthora infestans. In an assay on leaf discs, released and encysted zoospores of P. cubensis could be found, but only few germ tubes were formed. The growth of mycelia of P. infestans was also inhibited by both gramicidin S and the plant extract. Moreover, preliminary trials were performed to evaluate if induced resistance – besides a direct effect on the pathogen – might contribute to the overall protective effect of both preparations. Using DAB-staining, an increase of reactive oxygen species was observed after treatment of leaf discs with both A. migulanus culture supernatant and the plant extract. This very strong reaction did not occur after treating the leaf discs with sedimented bacterial cells or gramicidin S. The investigation of the expression of plant stress related enzymes using quantitative real time PCR showed a strong up-regulation of peroxidase encoding gene. The PR-1 encoding gene was slightly up-regulated as compared to water treated controls. Although the direct effect of the preparations was proven, an induction of resistance could not be fully excluded. Further investigations are required to completely elucidate this question. During serial subcultivation of the bacterial culture in liquid medium (TSB), a dissociation into different phenotypes occurred. One strain, termed “A. migulanus white”, was isolated which showed similar colony morphology, number of spores, and amount of the metabolite (gramicidin S) as A. migulanus wild type. Another strain with atypical morphology was noticed. Its colony was translucent, it produced less cells, and it was unable to form spores, but produced the metabolite gramicidin S. Phylogenetic analyses of 16S rRNA-encoding genes collocated both strains with the A. migulanus type-strain (DSM 2895T). These results were supported by sequence similarity of 99.9 – 99.7% as calculated from a p-distance matrix. For the use of A. migulanus in commercial trials a huge amount of culture broth is necessary. Previous investigations showed that it is difficult to cultivate the bacteria in a liquid fermenter (7L), where A. migulanus formed spores, but produced only very small amounts of gramicidin S. Own investigations showed that cultivation on solid medium (TSA) was possible without difficulties. The yield of gramicidin S was similar to the yield obtained after cultivation in 1L-Erlenmeyer flasks (200ml TSB). However, on solid media the biosurfactant was either not produced or it diffused into the medium. Therefore, the efficacy of bacterial preparations from solid media is based uniquely on the metabolite produced. In Germany the extract of M. cordata is sold as additive for animal feed (Phytobiotics GmbH), and little is known about the spectrum of activity against phytopathogens. In spite of the very good efficacy against downy mildews, no efficacy against the ascomycete fungus Podosphaera xanthii, the causative agent of powdery mildew of cucumber, was observed. In concentrations above 1000µg/ml the plant extract showed activity against seed-borne pathogens of carrot (Alternaria dauci and A. radicina) in vivo. Under in vitro conditions on solid medium the growth of mycelia of Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, and Phytophthora infestans was inhibited at concentrations of 20-50µg/ml, giving first indications on the spectrum of activity of M. cordata extract and its possible use in plant protection. However, it is self-evident that these results have to be further corroborated in trials on plants under both controlled and commercial conditions.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 07 Jan 2013 08:55
Last Modified: 07 Jan 2013 08:55
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-31808
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Ullrich-Eberius, Prof. Dr. Cornelia
Refereed: 1 November 2012
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3180
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