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Analyse einer divergenten Promotorregion in Halobacterium salinarum: Wirkung einzelner Promotorelemente und Stärke der Aktivierung

Marschaus, Larissa Renée :
Analyse einer divergenten Promotorregion in Halobacterium salinarum: Wirkung einzelner Promotorelemente und Stärke der Aktivierung.
TU Darmstadt, Darmstadt, Deutschland
[Ph.D. Thesis], (2012)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Analyse einer divergenten Promotorregion in Halobacterium salinarum: Wirkung einzelner Promotorelemente und Stärke der Aktivierung
Language: German
Abstract:

Das halophile Archaeon Halobacterium salinarum PHH1 bildet Gasvesikel über 14 gvp-Gene, die in den zwei gegenläufig orientierten Genclustern gvpACNO und gvpDEFGHIJKLM angeordnet sind. Die Promotoren der Gene gvpA (PA) und gvpD (PD) sind nur 35 Nukleotide voneinander getrennt. PA weist dabei die stärkere, PD eine schwächere Aktivität auf. Reguliert wird die Gasvesikelbildung durch den Transkriptionsaktivator GvpE, während GvpD an der Repression beteiligt ist. Für die GvpE-vermittelt Aktivierung der Promotoren PA und PD ist jeweils eine 20 Nukleotide (nt) lange GvpE upstream activator sequence (GvpE-UAS) notwendig, die an das Promotormotiv BRE angrenzt, das dem Transkriptionsfaktor B (TFB) als Erkennungsstelle dient. Die GvpE-UAS enthält zwei 8 nt langen Elemente (1+2), die durch 4 nt voneinander getrennt sind. Aufgrund des geringen räumlichen Abstands von PA und PD überlappen die beiden distalen GvpE-UAS-Elemente 1A und 1D im Zentrum der intergenen Region fast vollständig. Die Eigenschaften der GvpE-UAS von PA und PD wurden näher untersucht. Dafür wurden Substitutionsmutagenesen durchgeführt, um die Signifikanz der 8-nt Elemente 1A+2A, sowie 1D+2D für die Aktivierung des entsprechenden Promotors in vivo zu bestimmen. Die beiden Promotoren wurden dazu sowohl einzeln (PA-bgaH und PD-bgaH Konstrukte) als auch in dualen Promotorkonstrukten (pApD-bgaH und pDpA-bgaH) bezüglich ihrer basalen und GvpE-induzierten Aktivität in Haloferax volcanii Transformanten untersucht. Der bgaH-Leserahmen diente dabei als Reporter; die BgaH-Aktivität kann über einen ONPG-Test quantifiziert werden. In den dualen Promotorkonstrukten wurde die Aktivität des jeweilig anderen Promotors über die Menge der p-gvpA- bzw. p-gvpD-Transkripte bestimmt. Die Substitution von einem der beiden PA-GvpE-UAS-Elemente 1A oder 2A mit einer nonsense Sequenz (1A+∆2A bzw. ∆1A+2A) führte zu einem Verlust der Aktivierung von PA, während die Konfiguration 1A+1A der PA-GvpE-UAS eine Reduktion der Aktivierung zur Folge hatte. Die basale und GvpE-stimulierte Promotoraktivität von PD blieb dagegen - mit der Ausnahme von ∆1A+2A - durch diese PA-GvpE-UAS-Substitutionen unbeeinflusst: Die Substitution ∆1A+2A der PA-GvpE-UAS führte zu einer Reduktion der GvpE-vermittelten PD-Aktivierung. Bei der Aktivatorsequenz von PD führte die Konfiguration 1D+1D zu einem Verlust (Einzelpromotorkonstrukt) bzw. einer starken Einschränkung (duales Promotorkonstrukt) der GvpE-Aktivierung, was für eine sehr starke Orientierung der GvpE-UAS 1A/1D-Sequenz in Richtung PA spricht. Dies gewährleistet wahrscheinlich die effizientere Aktivierung von PA im Vergleich zu PD. Auch PD war in der GvpE-UAS-Konfiguration ∆1D+2D bzw. 1D+∆2D nicht mehr aktivierbar. Für die GvpE-vermittelte Aktivierung beider Promotoren ist deshalb eine vollständige GvpE-UAS aus zwei funktionalen 8-nt-Elementen notwendig. Die Konfiguration 2D+2D stimulierte den PD Promoter fast wie die Wildtyp-Konfiguration 1D+2D. Die basale und GvpE-stimulierte Promotoraktivität von PA wurde durch diese PD-GvpE-UAS-Substitutionen nicht beeinflusst. Die nahe Lokalisation der GvpE-UAS zur TFB-Bindestelle BRE impliziert, dass GvpE und TFB interagieren. Die Interaktion zwischen TfbC und GvpE wurde mittels Affinitätschromatographie gezeigt. Hier wurden auch verschiedene GvpE-Mutanten analysiert, die ihre Aktivatorfunktion verloren haben. Alle untersuchten GvpE-Mutanten hatten aber noch die Fähigkeit zur Interaktion mit TfbC. Um die Ursache für die Unterschiede in der Promotoraktivität von PA und PD zu bestimmen, wurden Promotorchimären hergestellt, bei denen die Motive BRE, TATA-Box und GvpE-UAS einzeln oder gemeinsam ausgetauscht waren. Durch den Austausch der GvpE-UAS wurde die Stärke der GvpE-vermittelten Promotoraktivierung ermittelt. PD wurde mit der PA-GvpE-UAS stärker und vice versa PA mit der PD-GvpE-UAS schwächer durch GvpE aktiviert. Alle PA-Motive waren in der Umgebung von PD funktional und der Austausch von BRE und/oder TATA-Box führte jeweils zu einer Erhöhung der GvpE-Aktivierung der PD-Chimäre. Dadurch wurde die Wichtigkeit von BREA und TATA-BoxA für die Stärke von PA belegt. Im Gegensatz dazu bewirkte BRED in der PA-Chimäre eine starke Reduktion der Basalaktivität und der GvpE-vermittelten Aktivierung. TATAA konnte jedoch gegen TATAD ohne Beeinflussung der Aktivität ausgetauscht werden. Die vollständige Inversion aller Promotorelemente übertrug die stärkere PA-Aktivität auf PD und vice versa die schwächere PD-Aktivität auf PA. Somit tragen alle Elemente des PA Promoters zur Stärke der Expression bei. Für PD wurde auch die Region zwischen TATA-Box und Transkriptionsstart durch eine 4-nt scanning Mutagenese gezielt analysiert. Es wurde ein neues regulatorisches Element zwischen TATAD und dem Transkriptionsstart identifiziert, das für die basale PD-Aktivität wichtig ist. Ein ähnliches Element existiert für PA nicht. Wegen des Funktionsverlustes von BRED in der Umgebung von PA und dem neuen regulatorischen Element in PD könnte PD von einem anderen TFB-Protein erkannt und gebunden werden als PA. Dies wäre eine mögliche Erklärung für die unterschiedliche, wachstumsphasenabhängige Aktivität beider Promotoren.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The gas vesicles produced by the extremely halophilic archaeon Halobacterium salinarum PHH1 are encoded by 14 gvp genes arranged in the two oppositely oriented clusters gvpACNO and gvpDEFGHIJKLM. The promoters of gvpA (PA) and gvpD (PD) are separated by 35 nucleotides only and PA shows a stronger activity than PD. The regulation of the gas vesicle formation involves the transcription activator GvpE and the repressing protein GvpD. The GvpE-mediated activation depends on a 20 nucleotide GvpE upstream activator sequence (GvpE-UAS) located close to the transcription factor B recognition element (BRE) of PA or PD. Each GvpE-UAS consists of two 8-nt elements (1+2) separated by 4 nt. Due to the short distance of PA and PD the distal GvpE-UAS elements 1A and 1D overlap almost completely in the center of the intergenic region. The characteristics of GvpE-UAS of PA and PD were investigated in more detail. Substitution mutageneses were performed to investigate the significance of the 8-nt elements 1A and 2A as well as 1D and 2D for promoter activation in Haloferax volcanii transformants. The basal and GvpE-induced activities were determined using single (PA-bgaH and PD -bgaH) or dual (pApD-bgaH and pDpA-bgaH) promoter constructs. The bgaH reading frame served as a reporter and the BgaH activity was quantified by ONPG assay. For the simultaneous measurement of the activity of the opposite promoter the amount of gvpA mRNA (in the case of pApD-bgaH), or gvpD mRNA (pDpA-bgaH) was determined. Substitution of either 1A or 2A with a nonsense sequence (1A+Δ2A or Δ1A+2A) led to the loss of the GvpE-mediated activation of PA whereas the GvpE-UASA configuration 1A+1A resulted in a reduction of the activation. The basal and GvpE-mediated promoter activities of PD were not influenced by these GvpE-UASA substitutions except for Δ1A+2A, where a reduction of the GvpE-mediated activation of PD was observed. Regarding the activator sequence of PD, the configuration 1D+1D resulted in a loss of GvpE-mediated activation (single promoter construct) or a strongly reduced GvpE-induced PD activity (dual promoter construct) indicating a stronger orientation of the overlapping 1A/1D sequence towards PA. Thus, PA is more efficiently induced compared to PD. Substitution of either 1D or 2D of GvpE-UASD with a nonsense sequence (Δ1D+2D or 1D+Δ2D) led to a loss of the GvpE-mediated PD activation underlining that a complete GvpE-UAS is required. The 2D+2D-mutant showed a GvpE-mediated activity comparable to the wild type configuration 1D+2D. The basal and GvpE-stimulated promoter activities of PA were not influenced by these GvpE-UASD substitutions. The close location of GvpE-UAS and BRE implies an interaction of GvpE and transcription factor TFB. Different GvpE mutants that lost the activator function were analyzed with respect to a possible interaction with TfbC. All of these mutants were able to interact with TfbC. To determine the reason for the differences in the PA and PD activities, promoter chimers were constructed carrying an exchange of the BRE, TATA box and/or GvpE-UAS vice versa. The exchange of GvpE-UAS resulted in an increased PD activity by GvpE-UASA whereas GvpE-UASD positioned in front of PA led to a decrease in the GvpE-mediated PA activation. All promoter elements of PA functioned in the environment of "PD". An exchange of BRE and/or TATA box resulted to an increase of the GvpE-activation of "PD", indicating that BREA and TATAA contribute to the strength of PA. In contrast, the basal and GvpE-induced activities of "PA" were strongly reduced by BRED, whereas the exchange of TATAA by TATAD did not affect the activity. A complete inversion of all promoter elements transferred the stronger PA activity to "PD" and vice versa the weaker PD activity to "PA". Thus, all elements of the PA promoter contribute to the strength of PA. A 4-nt scanning mutagenesis of the region between the TATAD and the transcription start site of gvpD uncovered a new regulatory element influencing the basal PD activity. A similar element for PA has not been observed. This element might be the reason for the loss of function of BRED in "PA". In combination with BRED this regulatory element might be recognized by a different TFB protein and might explain the differences in growth phase-dependent activity of PA and PD.English
Place of Publication: Darmstadt, Deutschland
Uncontrolled Keywords: halophile Archaea, Gasvesikel, Genregulation, Promotor, Transkriptinsaktivator, Transkrptionsfaktor, Transkriptionsfaktor B Erkennungselement (BRE)
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
halophilic Archaea, gas vesicle, gene regulation, promoter, transcription activator, transcription factor, transcription factor B recognition element (BRE)English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology > Microbiology & Genetics > Microbiology and Archaea
Date Deposited: 23 Nov 2012 14:53
Last Modified: 07 Dec 2012 12:06
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-31549
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas and Kletzin, PD Dr. Arnulf
Refereed: 21 September 2012
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3154
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