TU Darmstadt / ULB / tuprints

Funktionelle Charakterisierung von RNA abhängigen RNA Polymerasen aus Dictyostelium discoideum

Wiegand, Stephan :
Funktionelle Charakterisierung von RNA abhängigen RNA Polymerasen aus Dictyostelium discoideum.
TU Darmstadt / Fachbereich Biologie
[Ph.D. Thesis], (2012)

[img]
Preview
Text
Funktionelle_Charakterisierung_von_RNA_abh%C3%A4ngigen_RNA_Polymerasen_aus_Dictyostelium_discoideum.pdf
Available under Creative Commons Attribution Non-commercial No Derivatives.

Download (3747Kb) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Funktionelle Charakterisierung von RNA abhängigen RNA Polymerasen aus Dictyostelium discoideum
Language: German
Abstract:

Zellulär kodierte RNA abhängige RNA Polymerasen (RNA-dependent RNA polymerases, RdRPs) katalysieren die Synthese eines RNA Strangs komplementär zu einer einzelsträngigen RNA Matrize. RdRPs sind in vielen eukaryotischen Organismen in RNA-vermittelte Genregulationsprozesse involviert und in einigen Organismen notwendig für einen funktionierenden RNA Interferenz (RNAi) Mechanismus (zusammengefasst in Maida and Masutomi, 2011). Vor Beginn dieser Arbeit konnten im Genom von Dictyostelium discoideum drei Gene identifiziert werden, welche für die RdRP Homologe RrpA, RrpB und RrpC kodieren (Martens et al., 2002).

Zur funktionellen Charakterisierung der RdRP Homologe in D. discoideum wurden mittels homologer Rekombination RdRP single, double und triple Deletionsstämme in allen möglichen Kombinationen generiert. Hierbei wurde zur Herstellung von Gendeletionsvektoren das pKOSG System entwickelt, das auf dem StarGate®-combinatorial cloning System und dem pLPBLP Vektor basiert (Wiegand et al., 2011). Die für die homologe Rekombination notwendigen Bereiche, können bei diesem System in Form von zwei PCR Produkten durch combinatorial cloning in einer höchst effizienten Einschritt-Reaktion in ein allgemeines, organismenspezifisches Akzeptor System integriert werden. In vergleichenden Studien von Gendeletionsvektoren, welche mittels konventioneller Klonierung erstellt wurden, konnten keine funktionellen Unterschiede festgestellt werden. Aufgrund des deutlich reduzierten Zeit- und Materialaufwands bei der Erstellung von Gendeletionsvektoren, stellt das neu entwickelte pKOSG System eine deutliche Verbesserung gegenüber einer konventionellen Klonierungsstrategie dar.

Im Weiteren wurde der Einfluss von RdRPs und DrnB, einem Dicer-ähnlichen Protein in D. discoideum, auf endogene RNAs untersucht. Zunächst wurde festgestellt, dass RdRPs in D. discoideum nicht essentiell sind. Dennoch haben sie eine zentrale Funktion im RNA vermittelten Stilllegungsmechanismus der LTR Retrotransposons DIRS-1 und Skipper. Hierbei wurde in Northern Analysen erstmalig eine bidirektionale Transkription von DIRS-1 Elementen detektiert. Des Weiteren konnte eine drastische Reduktion von DIRS-1 spezifischen siRNAs in Northern Blots und in deep sequencing Analysen in allen untersuchten rrpC Deletionsstämmen festgestellt werden. Parallel wurde eine Akkumulation von DIRS-1 sense Transkripten in diesen Stämmen beobachtet. Mit Hilfe dieser Ergebnisse lässt sich ein Modell für einen RNA-vermittelten Stilllegungsmechanismus von DIRS-1 postulieren. Bidirektionale DIRS-1 Transkripte, welche aus der Promotoraktivität der invertierten LTRs resultieren, werden demnach zunächst durch das Dicer-ähnliche Protein DrnA zu primären siRNAs prozessiert. Im Folgenden vermittelt RrpC die Synthese von sekundären siRNAs, wobei primäre siRNAs als Primer an der DIRS-1 sense RNA fungieren. Die durch RrpC synthetisierten Doppelstränge werden wiederum durch DrnA geschnitten woraus ein post-transkriptioneller Abbau der DIRS-1 sense Transkripte resultiert. Im Gegensatz zu DIRS-1 siRNAs akkumulierten Skipper spezifische siRNAs in rrpC Deletionsstämmen. Überraschenderweise wurde eine Anreicherung von längeren Skipper spezifischen Transkripten in rrpA Deletionsstämmen und vor allem im drnB Deletionsstamm beobachtet. Darüber hinaus konnte in rrpC Deletionsstämmen eine drastische Akkumulation von zwei putativen micro RNAs detektiert werden. Dies deutet auf mögliche regulatorische Funktionen von RrpC in der Biogenese von micro RNAs hin, was im Einklang mit bereits publizierten Untersuchungen steht (Hinas et al., 2007).

Zur Analyse des RNAi Mechanismus in D. discoideum wurden zwei Reportersysteme entwickelt. Im ersten konnte die Menge an mRNA des Endogens cadA durch Transkription von extrachromosomalen sequenzhomologen cadA Silencing Konstrukten reduziert werden. Nur durch Einsatz eines hairpin Konstrukts, welches annährend die gesamte kodierende Sequenz von cadA abdeckte, konnte eine Reduktion der mRNA in allen RdRP Deletionsstämmen ausgelöst werden. Bei Expression von kürzeren hairpin RNAs sowie bei antisense RNAs wurden dagegen keine Veränderungen beobachtet. CadA spezifische siRNAs, welche aus der Prozessierung des primären Auslösers resultieren, konnten dagegen für alle exprimierten hairpin und antisense RNAs nachgewiesen werden, wobei deren Menge und Prozessierung unabhängig von der Aktivität von RdRPs erfolgte, da sich alle untersuchten RdRP Deletionsstämme wie der AX2 Wildtyp verhielten.

Mit dem ß-Gal Reportersystem konnte ein zweites, heterologes System zur Untersuchung von RNA-vermittelten Genregulationsprozessen in D. discoideum etabliert werden. Die Expression des Transgens lacZ und die nachfolgende Expression von sequenzhomologen ß-gal Silencing Konstrukten, erfolgte hierbei von zwei getrennten Vektoren mit unterschiedlichen Selektionsmarkern. Die ß-Gal Aktivität konnte durch Expression einer hairpin RNA, aber auch durch Expression einer antisense RNA im AX2 Wildtyp und in allen untersuchten RdRP und drnB Deletionsstämmen um mindestens 50% reduziert werden. Dies wurde jedoch nicht durch eine Reduktion der lacZ mRNA Menge verursacht, die in beiden Fällen konstant blieb. Nachweise von siRNAs nach Expression der ß-gal hairpin RNA zeigten, dass eine Prozessierung zu siRNAs erfolgte, was in schwächerem Maße auch für die antisense RNA beobachtet wurde. Diese wirken demnach als Inhibitoren der Translation. Zusätzlich wurde nach Expression der ß-gal hairpin RNA ein spreading von ß-gal siRNAs 5´ zur Position des primären Auslöser beobachtet. Die Entstehung dieser sekundären siRNAs erfolgte in Abhängigkeit von rrpC und drnB. Die Ergebnisse beider Reportersysteme deuten darauf hin, dass RdRPs nicht zwingend notwendig für RNAi-vermitteltes post-transkriptionelles Silencing und translationale Repression in D. discoideum sind.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Cellular encoded RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) catalyse the formation of complementary RNA strands, using a single-stranded RNA molecule as their template. RdRPs are in numerous eukaryotes in RNA-mediated gene regulation processes involved and in some organisms required for RNA interference (summarized in Maida and Masutomi, 2011). Previous studies identified in the genome of the single cell amoeba Dictyostelium discoideum three genes, which encode the RdRP homologues RrpA, RrpB and RrpC (Martens et al., 2002). For functional characterization of three RdRPs in D. discoideum RdRP single, double and triple deletion strains in all possible combinations were generated by homologous recombination. For this purpose, the pKOSG system for generation of gene deletion plasmids was established, which is based on the Star Gate® combinatorial cloning system and the pLPBLP vector (Wiegand et al., 2011). This system allows the integration of the two areas required for homologous recombination in a one-step reaction by inserting two PCR products into an organism-specific generic acceptor system. Comparative studies to deletion vectors, which were generated by conventional cloning, showed no functional differences. Saving cost and time, the established pKOSG system represents a significant advancement in the generation of gene deletion plasmids compared to conventionally cloning approaches. Furthermore the influence of RdRPs and DrnB, a Dicer-like protein in D. discoideum on endogenous RNAs was examined. First, it was found, that RdRPs in D. discoideum are not essential. However, they have a central role in RNA-mediated silencing of the LTR retrotransposons DIRS-1 and Skipper. Using Northern blots, it was possible to detect bidirectional transcripts of the DIRS-1 retrotransposon. Deep sequencing analysis and Northern blots for detection of small RNAs revealed a dramatic reduction of DIRS-1 specific siRNAs in all investigated rrpC deletion strains. In parallel, an accumulation of longer DIRS-1 sense transcripts was observed in these strains. The results obtained in these studies can be used to postulate a model of the RNA-mediated silencing mechanism from DIRS-1. Bidirectional DIRS-1 transcripts, which result from the promoter activity of the inverted LTRs, therefore can be initially processed by the Dicer-like protein DrnA to primary siRNAs. In the next step RrpC mediates the systhesis of secondary siRNAs using primary siRNAs as their primers, to the DIRS-1 sense RNA. The double strands synthesized through RrpC, are again processed by DrnA, resulting in a post-transcriptional degradation of DIRS-1 sense transcripts. Unlike DIRS-1 siRNAs Skipper specific siRNAs accumulated in rrpC deletion strains. Surprisingly, an enrichment of longer Skipper specific transcripts was observed only in rrpA deletion strains and especially in the drnB deletion strain but not in the absence of rrpC. Moreover a dramatic accumulation of two putative micro RNAs in rrpC deletion strains was detected. These points to possible regulatory functions of RrpC in the biogenesis of micro RNAs, which is consistent with previously published studies (Hinas et al., 2007). For analysis of the RNAi mechanism in D. discoideum two reporter systems were developed. In the first, the amount of mRNA for the endogene cadA was reduced, by the use of sequence homologous cadA silencing constructs, which are transcribed on extrachromsomal vectors. Only through a hairpin construct, which nearly covered the entire coding sequence of cadA, a reduction of the mRNA was triggered in all RdRP deletion strains. No changes were caused, when shorter hairpin RNAs or an antisense RNA were expressed. CadA specific siRNAs, which result from the processing of the primary trigger could be detected for all expressed hairpin and antisense RNAs, wherein the amount and the processing was carried out independently of the activity of RdRPs. All examined RdRP deletion strains behaved like AX2 wild type. With the ß-Gal reporter system a second, heterologous system for studying RNA-mediated gene regulation in D. discoideum was established. Expression of the lacZ transgene and the subsequent expression of sequence homologous ß-gal silencing constructs, accrue in this case from two separate vectors with different selection markers. The expression of a hairpin RNA and of an antisense RNA led in AX2 wild type and in all the studied RdRP and drnB deletion strains to a reduction of the ß-gal activity by at least 50%. This was not caused through a reduction of the ß-gal mRNA levels, as they stayed constant in both cases. Detection of ß-gal siRNAs after the expression of the ß-gal hairpin RNA showed that processing to siRNAs was carried out. To a lesser extent, this was also observed for the antisense RNA. Accordingly these ß-gal siRNAs act as inhibitors of the translation. In addition, the expression of a ß-gal hairpin RNA resulted in spreading of ß-gal siRNA 5´ to the position of the primary trigger. The occurrence of these secondary siRNAs was dependent on the presence of rrpC and drnB. The results of both reporter systems indicate that RdRPs are not necessarily required for RNAi-mediated post-transcriptional silencing and translational repression in D. discoideum.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 12 Sep 2012 12:29
Last Modified: 03 Sep 2013 22:04
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-30997
Referees: Hammann, Prof. Dr Christian and Göringer, Prof. Dr. H. Ulrich
Refereed: 17 July 2012
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3099
Export:

Actions (login required)

View Item View Item