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Role of Interdomain and Intersubunit Contacts for NMDA Receptor Function

Tamer, Ceyhun :
Role of Interdomain and Intersubunit Contacts for NMDA Receptor Function.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2012)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Role of Interdomain and Intersubunit Contacts for NMDA Receptor Function
Language: English
Abstract:

Ionotropic glutamate receptors (iGluRs) are tetrameric ligand-gated ion channels that convey the majority of excitatory neurotransmission in the mammalian central nervous system. Members of the iGluR family are AMPA and kainate receptors as well as NMDA receptors. NMDA receptors are unique among the iGluRs due to the obligate heteromeric assembly and their particular roles for learning and memory formation but on the other hand NMDA receptor mediated excitotoxicity causes cell death in various pathophysiological conditions and neurodegenerative disorders. Conventional NMDA receptors are composed of two glycine binding Glun1 subunits and two glutamate binding GluN2 subunits. These receptors are also referred to as ‘coincidence detectors’ as for the activation a predepolarization of the postsynaptic membrane and ligand binding is required. Receptors composed of two glycine binding GluN1 and two glycine binding GluN3 subunits are referred to as ‘excitatory glycine receptors’. Each iGluR subunit has a modular structure and it is hypothesized that each module/domain originates from a prokaryotic ancestral protein. The extracellular N-terminal domains (NTDs) are thought to form local heterodimers between GluN1 and GluN2 or GluN3 NTDs, additionally the GluN2- or GluN3-NTDs form a homodimeric contact. The ligand-binding domains (LBDs) of GluN1 and GluN2 or GluN3 subunits are arranged in a ‘back-to-back’ conformation forming the LBD heterodimer interface, which is subdivided into three distinct sites (sites I-III). This heterodimer interface has been previously implicated in receptor desensitization, weak interface interactions increase receptor desensitization. Upon ligand-binding, the S1 and S2 subdomains of the LBDs close in a ‘venus-flytrap’ like fashion. The transmembrane domains (TMDs) of iGluRs show homology to prokaryotic K+ channels but iGluR TMDs have one transmembrane domain (TM4) more than the prokaryotic ion channel. The aim of the work presented here was to analyze intra- and intersubunit interface interactions in the NTDs, LBDs and TMDs to determine their functional implications. To achieve this, in vitro and in silico methods were combined. Molecular docking experiments and homology modelling were used to gain insight into the molecular mechanism of agonism, partial agonism and antagonism. The results indicate that for GluN1 subunits it is the size of the ligand that determines its action, i.e. agonists are small, partial agonists are slightly larger and antagonists are large molecules. However, this could not be validated for GluA2-type AMPA receptor subunits, GluN2A or GluN3A subunits. Thus, the mechanism for partial agonism seems to be not conserved but subunit specific. In order to gain insight into the role of the GluN1-GluN2 LBD heterodimer interface we analyzed the GluN1-GluN2A LBD crystal structure as well used the mutual information (MI) analysis to select amino acids for site-directed mutagenesis. The respective mutants were functionally characterized by two-electrode voltage-clamp on Xenopus oocytes. The results did not show specific effects of the mutations, hence it is not possible to imply one interaction site to one function. We conclude that the interface as a network of interactions is generally involved in receptor function. However, one mutation in site III largely decreased agonist-induced currents from NTD-lacking GluN1/GluN2 receptors. Whether this effect is caused by reduced subunit expression, receptor assembly or trafficking needs to be disclosed in further experiments. Homology model based analysis and subsequent site-directed mutagenesis and functional characterization of GluN1/GluN3A receptors led to the identification of specific residues in the GluN3A-NTD that selectively increased the receptor efficacy. Thus, the GluN3A-NTD resembles the role of an autoinhibitory domain (AID), to our knowledge no AID has been described so far for ligand-gated ion channels. In a last set of experiments we assessed interactions between the GluN1 TM4 and the TM1 and TM3 of the neighboring GluN2A subunit. Amino acid substitutions were selected based on our GluN1-GluN2A TMD model and functional characterization by TECV revealed two residues that almost completely abolished receptor function. We further used the MI analysis to probe for positions that are evolutionary interdependent and from the position of these correlations we inferred that the TM4 is mainly involved in stabilizing the TMD and thus ensuring proper ion channel function.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs) sind tetramere liganden-gesteuerte Ionenkanäle, die im Zentralnervensystem von Säugern für den Großteil der exzitatorischen Signalweiterleitung verantwortlich sind. Zur iGluR Familie gehören die AMPA-, Kainat- und NMDA-Rezeptoren. Den NMDA-Rezeptoren wird eine besondere Rolle zugeschrieben, da sie obligate heteromere Komplexe bilden und eine besondere Rolle für das Lernen und die Gedächtnisbildung spielen. Andererseits sind sie auch an pathophysiologischen Vorgängen und neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt, da NMDA-Rezeptor vermittelte Exzitotoxizität zum Zelltod führt. Konventionelle NMDA-Rezeptoren bestehen aus zwei Glyzin-bindenden GluN1-Untereinheiten (UEs) und zwei Glutamat-bindenen GluN2-UEs. Dieser Rezeptortyp wird auch als “Koinzidenz-Detektor” bezeichnet, da zusätzlich zur Ligandierung eine Vordepolarisation der postsynaptischen Membran notwendig ist. Rezeptoren, die aus zwei Glyzin-bindenden GluN1-UEs und zwei Glyzin-bindenden GluN3-UEs bestehen, werden als “exzitatorische Glyzin-Rezeptoren” bezeichnet. Jede iGluR-UE hat einen modularen Aufbau und es wird vermutet, dass jedes Modul bzw. jede Domäne von einem prokaryotischen Vorläuferprotein abstammt. Die extrazellulären N-terminalen Domänen (NTDs) bilden lokale Heterodimere zwischen GluN1- und GluN2- oder GluN3- NTDs, zusätzlich bilden die GluN2- oder GluN3-NTDs untereinander homodimere Kontakte. Die Ligandenbindedomänen (LBDs) der GluN1- und GluN2- oder GluN3-UEs sind in einer “Rücken-an-Rücken” Konformation angeordnet. Die Kontaktfläche zwischen den beiden LBDs wird in drei Kontaktstellen unterteilt (Kontaktstellen I-III). Diese Kontaktfläche wurde zuvor mit der Rezeptordesensitisierung in Verbindung gebracht, schwache Interaktionen an der Kontaktfläche würden demnach die Desensitisierung verstärken. Die Ligandenbindung führt dazu, dass die beiden Subdomänen der LBD, S1 und S2, sich in einem “Venus-Fliegenfallen” artigen Mechanismus schließen. Die Transmembranregionen (TMDs) der iGluRs zeigen Homologien zu prokaryotischen Kalium-Kanälen, aber sie unterscheiden sich vorallem darin, dass die TMDs von iGluRs eine vierte Membrandomäne (TM4) besitzen, die im Kalium-Kanal nicht vorhanden ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es Kontaktflächen innerhalb einer Untereinheit und zwischen Untereinheiten in den NTDs, LBDs und TMDs zu untersuchen, um die jeweilige Rolle für die Rezeptorfunktion besser zu verstehen. Hierfür wurden in vitro und in silico Methoden miteinander kombiniert. Docking-Experimente mit Kristallstrukturen und Homologiemodellen wurden durchgeführt, um den Mechanismus des Agonismus, partiellen Agonismus und Antagonismus an NMDA-Rezeptoren besser zu verstehen. Die Ergebnisse zeigten, dass bei der GluN1-UE vorallem die Größe des Liganden seine Aktivität bestimmt. Demnach sind Agonisten immer kleine Moleküle, partielle Agonisten sind größer als Agonisten und Antagonisten sind große Moleküle. Dieses konnte aber nicht für die GluA2-UE der AMPARs oder für GluN2A- und GluN3A-UEs der NMDARs gezeigt werden. Wir schließen daraus, dass der zugrundeliegende Mechanismus für den partiellen Agonismus untereinheitenspezifisch ist. Für die Untersuchung der Kontaktfläche zwischen den GluN1-GluN2 LBDs wurde die Kristallstruktur näher betrachtet und mit Hilfe der Transinformations-Analyse (TI) Aminosäuren für Substitutionsexperimente ausgesucht. Die daraus resultierenden mutierten Rezeptorkomplexe wurden funktionell mit der Zwei-Elektroden Spannungsklemme (TEVC) an Xenopus Oozyten charakterisiert. Die Ergebnisse ließen nicht auf spezielle Funktionen der drei Kontaktstellen schließen. Es erscheint wahrscheinlicher, dass die Kontaktfläche allgemein in der Rezeptorfunktion eingebunden ist. Eine Mutation jedoch an der Kontaktstelle III zeigte bei NTD-trunkierten GluN1/GluN2 Rezeptoren eine Erniedrigung des Agonisten-induzierten Stromes. Ob diese Mutation die Expression, Assemblierung oder Zelloberflächenexpression stört ist nicht bekannt und muss in zukünftigen Experimenten näher untersucht werden. Homologiemodell-basierte Analyse gefolgt von Aminosäuresubstitution und funktioneller Charakterisierung von mutierten GluN1/GluN3A Rezeptoren, ermöglichte die Identifizierung von Aminosäureresten in der GluN3A-NTD, die spezifisch für die niedrige Effizienz von Glun1/GluN3A Rezeptoren verantwortlich sind. Daher kann der GluN3A-NTD die Rolle einer autoinhibitorischen Domäne (AID) zugeschrieben werden. Nach unseren Kenntnissen ist bisher noch keine AID für liganden-gesteuerte Ionenkanäle bekannt. Letztlich wurden die Interaktionen zwischen der GluN1-TM4 und der TM1 und TM3 der GluN2A-UE untersucht. Aminosäurereste wurden aufgrund unseres Homologiemodells für Aminosäuresubstitutionsexperimente ausgewählt und funktionell mit der TEVC untersucht. Hierbei wurden zwei Positionen in der GluN1-TM4 identifiziert, deren Mutation zu nicht funktionellen Rezeptoren führte. Diese Positionen wurden weiter mit Hilfe der TI untersucht um evolutionär-abhängige Positionen in der TMD zu identifizieren. Anhand der Position dieser gefundenen Korrelationen lässt sich schlußfolgern, dass die TM4 wichtig für die Stabilität der TMD ist und nur durch diese Stabilisierung kann eine normale Funktion des Ionenkanals sichergestellt werden.German
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Biology > Zoology
Biology > Zoology > Neurosensory Systems
Date Deposited: 10 Sep 2012 07:35
Last Modified: 07 Dec 2012 12:05
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-30984
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Laube, Prof.Dr. Bodo and Hamacher, Prof.Dr. Kay
Refereed: 31 August 2012
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3098
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