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Entwicklung biotechnologischer Werkzeuge zur enzymkatalysierten Produktion makrozyklischer Moschusriechstoffe

Paschke, Maren :
Entwicklung biotechnologischer Werkzeuge zur enzymkatalysierten Produktion makrozyklischer Moschusriechstoffe.
TU Darmstadt / Chemie, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2012)

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Entwicklung_biotechnologischer_Werkzeuge_zur_enzymkatalysierten_Produktion_makrozyklischer_Moschusriechstoffe.pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Entwicklung biotechnologischer Werkzeuge zur enzymkatalysierten Produktion makrozyklischer Moschusriechstoffe
Language: German
Abstract:

Ziel dieser Arbeit war es, einen experimentellen Zugang zu schaffen, um mit Hilfe eines Klasse I-Aldolase-Mechanismus über eine Schiffbasen-Bildung die Zyklisierung eines linearen Diketons zu bewirken. Dazu wurden zunächst geeignete Proteingerüste ausgewählt, welche in Hinsicht auf der Größe und der Ladungen im Inneren ihrer Substrattasche, in der Lage sein sollten, eine solche Reaktion zu katalysieren. Durch den Einbau von Lysinresten an ausgewählten Aminosäure-Positionen im Inneren des aktiven Zentrums der Proteingerüste sollte die Aldolase-Reaktion über eine Schiffbasen-Bildung initiiert werden. Es konnte jedoch nicht gezeigt werden, dass die eingebauten Lysinreste mit dem Aldol-Marker Methodol reagieren. Da vermutet wurde, dass die installierten Lysinreste im Innern der Substrattasche nicht aktiv waren, wurden Aminosäuren in der näheren Umgebung der Lysinreste in einem Substratspezifischen Radius von 9 Å ausgesucht und über SOE-PCR mit degenerierten Primern die randomisierten Stellen eingebaut. Durch den Einfluss der zufällig eingebauten Aminosäuren sollten die installierten Lysinreste aktiviert werden. Zur Identifizierung aktiver Lysinreste wurden mehrere Muteinbibliotheken auf der Basis des Proteingerüstes der Polyketid-Cyclase SnoaL erstellt. Es wurden Display-Verfahren etabliert und die SnoaL-Muteinbibliotheken im Hochdurchsatz-Verfahren durchmustert. Für die Durchmusterung im Hochdurchsatz-Verfahren wurden sogenannte Suizid-Substrate synthetisiert, welche mit dem funktionellen Lysinrest über eine Schiffbase eine kovalente Bindung eingehen und somit als Marker für eine Klasse I Aldolase-Reaktion fungieren können. Es traten jedoch große Schwierigkeiten bei der Reinigung dieser Substrate auf. Außerdem mussten die Diketon-Derivate für den Einsatz des High-Throughput-Screenings durch die Kopplung eines Biotin-Linkers funktionalisiert werden. Auch hier erwies sich die Trennung der eingesetzten Edukte von dem gewünschten Produkt als äußerst schwierig und Letztere zeigten außerdem eine geringe Stabilität selbst bei -20 °C. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Isolation katalytischer Aldolase-Antikörper aus einer synthetischen und einer naiven VHH-Bibliothek. Aber auch aus diesen Bibliotheken konnte kein Substrat-Binder isoliert werden. Da bereits gezeigt werden konnte, dass mit Hilfe eines Hapten-Konjugats aus Diketon-Derivat und KLH durch Immunisierung mehrere Aldolase-Antikörper isoliert wurden (Barbas, 1997; Zhong, 1999), wurde diese Methode ebenfalls zur Gewinnung katalytischer Antikörper herangezogen. Da nach katalytischen Schwere-Ketten-Antikörpern gesucht wurde, erfolgte die Immunisierung eines Lamas mit dem Suizidsubstrat als Hapten-Konjugat. Wenn auch die Isolierung von SnoaL-Varianten oder VHH Antikörpern mit Aldolase-Aktivität nicht erfolgreich war, wurden Möglichkeiten und Grenzen bezüglich Enzymgrundgerüst, Display-Strategie, Durchmusterungsverfahren und Substratsynthese ausgelotet, die eine Risikobewertung und Kalkulation der Erfolgswahrscheinlichkeit künftiger, ähnlich gelagerter Produkte wesentlich erleichtern dürfte. Zusätzlich wurde für die spätere Quantifizierung der Produktbildung der Aldolase-Varianten ein kontinuierlicher Assay etabliert, bei dem mit Hilfe einer Cyclopentadecanone-Monooxygenase (CPDMO) ein Cofaktor-abhängiges, an die Produktbildung gekoppeltes Signal detektiert werden kann. Dafür konnte ein stabiles und reproduzierbares Expressionsystem aufgebaut werden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The aim of this study was to generate an experimental way to get a linear diktone cycled via class I-aldolase mechanism. First adequate protein scaffolds, which are able to catalyze such a reaction by the dimension and charge of their active side, were choosen. By the installation of lysine-residues at elected amino-acid-positions in the active site of the protein-scaffolds, the aldolase reaction should be initiated via Schiff-base formation. But the installed lysine-residues did not show any reaction to the aldol-sensor method. Because of the assumption, that the installed lysine-residues in the active site were inactivated, other amino-acid-residues were randomized. This randomization took place in a substrate-specific radius of about 9Å and got installed with SOE-PCR by degenerated primer. Under influence of these random amino-acids the installed lysine-residues should be activated. For the identification of active lysine-residues, several mutein-libraries based on the protein-scaffold of the polycetid-cyclase SnoaL, were constructed. Several display-strategies have been established and the SnoaL-mutein-libraries were screened by high-throughput methods. For the high-throughput screening, so called suicide-substrates were synthesized, which should bind to the functional lysine-residue via Schiff- base to act as a marker for a class-I-aldolase reaction. But many difficulties appeared by the purification of these substrates. In addition, the diktones had to be coupled with a biotin-linker for the high-throughput-screening. Also the separation of the educts and products was very problematic. Another aspect of this study was the isolation of catalytic aldolase-antibodies from a synthetic and a naïve VHH-library. But again no substrate-binder could get isolated from these libraries. Because it was shown before, that with the help of a hapten-conjugate of diketone and KLH, several aldose-antibodies could be isolated (Barbas, 1997; Zhong, 1999), that method was used for the winning of catalytic antibodies as well. For the search of heavy-chain-only antibodies the immunization of a Llama was performed with the suicide-substrate as hapten-conjugate. Even if the isolation of SnoaL-variants or VHH antibodies with aldolase-activity was not successful, possibilities and limits could be tested regarding enzyme-scaffold, display-strategy, screening-system and substrate-synthesis. For future quantification of the product generation of the aldolase-variants a continuous assay could be established, with a cyclopentadecanone-monooxigenase (CPDNO) for the detection of a signal, which is coupled on the product generation. A stable and reproducible expression system could be constructed.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Fachbereich Chemie
Date Deposited: 05 Sep 2012 09:34
Last Modified: 27 Aug 2013 22:04
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-30840
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Warzecha, Prof. Dr. Heribert
Refereed: 9 July 2012
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3084
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