Advancing Protein Characterisation: Integrating Native, Top-Down, and Ion Mobility Mass Spectrometry for Biological Insight

Complex biological processes cannot take place without the help of proteins. Proteins perform essential tasks in our cells, primarily through interactions with other proteins, other biomolecules, or small molecules. The functionality of this sophisticated system is mainly based on the right protein being in the right place at the right time with the correct folding. Errors in this system are in many cases triggers of disease either directly or through downstream processes. Therefore, expanding the understanding of all involved processes, especially the initiating ones, and potential errors is essential in research. Two levels play an important role in proteins. The first level involves the amino acid sequence with all potential modifications and is called the primary structure of proteins. The second deals with folding, conformation, and interaction partners of proteins. The terms secondary, tertiary, and quaternary are often used here, or, in summary, higher-order structure. Many different techniques have been and continue to be used to analyse proteins, and all have their characteristic strengths and weaknesses. The technique that plays the main role in this thesis is mass spectrometry. In addition to determining the mass of the analyte, mass spectrometry can provide further interesting insights into protein characteristics. If proteins are analysed intact without prior digestion, and then fragmented into smaller pieces in the mass spectrometer, this is referred to as the top-down approach. This approach allows the elucidation of the primary structure as well as the localization of post-translational modifications and is therefore one of the most effective techniques for the characterization of proteins and proteoforms. However, not only proteoform identification plays an important role in the understanding of biological processes, but also their higher-order structure is essential. Since this higher-level structure is often determined by labile, non-covalent interactions, the measurement conditions must be adapted to obtain it. These efforts have given rise to the field of native mass spectrometry. Native mass spectrometry allows the transfer of proteins and complexes in their native conformation into the mass spectrometer. In combination with the top-down approach, also known as native top-down analysis, information on proteoform identity can then be linked to 3D structural information. Another technique used in combination with mass spectrometry for protein structure elucidation is ion mobility spectrometry. This provides an additional separation dimension and is particularly useful for investigating differences in the conformation or folding of proteins. In the following work, the techniques described were used either alone or in combination to contribute to the development of methods in the relevant fields. One aim is to make methods accessible to a wider range of users and to establish standards and controls. This requires collaborative initiatives, and this thesis includes the result of such an endeavour. In addition, work was done to improve existing methodologies, and a review was published that explains the basics for beginners in the field. The challenge of obtaining sufficient fragmentation in top-down protein analysis was also targeted in one subsection. The last part of the thesis presents an application of the methodologies for basic research in the field of Alzheimer's dementia. Here, various proteoforms of the amyloid β peptide play an essential role in the disease and its progression. Native mass spectrometry in combination with ion mobility was used to investigate the differences between these proteoforms and to better understand their interactions. In summary, this thesis aims to show the possibilities and opportunities of native mass spectrometry, top-down protein analysis, and ion mobility, and above all, their application in protein characterisation.

Komplexe biologische Prozesse können ohne die Hilfe von Proteinen nicht ablaufen. Proteine erfüllen wesentliche Aufgaben in unseren Zellen, vor allem durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, anderen Biomolekülen oder kleinen Molekülen. Die Funktionsfähigkeit dieses ausgeklügelten Systems beruht vor allem darauf, dass das richtige Protein zur richtigen Zeit am richtigen Ort ist und die richtige Faltung aufweist. Fehler in diesem System sind in vielen Fällen Auslöser von Krankheiten, entweder direkt oder über nachgeschaltete Prozesse. Daher ist die Erweiterung des Verständnisses aller beteiligten Prozesse, insbesondere der auslösenden Prozesse, und möglicher Fehler von wesentlicher Bedeutung für die Forschung. Bei Proteinen spielen zwei Ebenen eine wichtige Rolle. Die erste Ebene umfasst die Aminosäuresequenz mit allen möglichen Modifikationen und wird als Primärstruktur der Proteine bezeichnet. Die zweite Ebene befasst sich mit der Faltung, Konformation und den Interaktionspartnern von Proteinen. In diesem Zusammenhang werden häufig die Begriffe Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur verwendet, oder, kurz gesagt, übergeordnete Struktur. Zur Analyse von Proteinen wurden und werden viele verschiedene Techniken eingesetzt, die alle ihre charakteristischen Stärken und Schwächen haben. Die Technik, die in dieser Arbeit die Hauptrolle spielt, ist die Massenspektrometrie. Neben der Bestimmung der Masse des Analyten kann die Massenspektrometrie weitere interessante Erkenntnisse über die Eigenschaften von Proteinen liefern. Werden Proteine intakt und ohne vorherigen Verdau analysiert und dann im MS in kleinere Teile zerlegt, spricht man vom Top-down-Ansatz. Dieser Ansatz ermöglicht die Aufklärung der Primärstruktur sowie die Lokalisierung von posttranslationalen Modifikationen und ist daher eine der effektivsten Techniken zur Charakterisierung von Proteinen und Proteoformen. Doch nicht nur die Identifizierung von Proteoformen spielt eine wichtige Rolle für das Verständnis biologischer Prozesse, sondern auch ihre übergeordnete Struktur ist von entscheidender Bedeutung. Da diese übergeordnete Struktur häufig durch labile, nicht kovalente Wechselwirkungen bestimmt wird, müssen die Messbedingungen angepasst werden, um sie zu erhalten. Die daraus resultierenden Anforderungen führten zur Entwicklung der nativen Massenspektrometrie. Die native Massenspektrometrie ermöglicht es, Proteine und Komplexe in ihrer nativen Konformation in das Massenspektrometer zu überführen. In Kombination mit dem Top-down-Ansatz, auch bekannt als native Top-down-Analyse, können dann Informationen über die Identität der Proteoform mit 3D-Strukturinformationen verknüpft werden. Eine weitere Technik, die in Kombination mit der Massenspektrometrie zur Aufklärung von Proteinstrukturen eingesetzt wird, ist die Ionenmobilitätsspektrometrie. Sie bietet eine zusätzliche Trenndimension und ist besonders nützlich für die Untersuchung von Unterschieden in der Konformation oder Faltung von Proteinen. In den Kapiteln der folgenden Dissertation wurden die beschriebenen Techniken entweder allein oder in Kombination eingesetzt, um zur Entwicklung von Methoden in den jeweiligen Bereichen beizutragen. Ein Ziel ist es, die Methoden einem breiteren Nutzerkreis zugänglich zu machen und Standards und Kontrollen zu etablieren. Dabei spielen kollaborative Initiativen eine entscheidende Rolle. Die vorliegende Arbeit präsentiert das Ergebnis einer solchen internationalen Zusammenarbeit. Darüber hinaus wurde an der Verbesserung bestehender Methoden gearbeitet, und es wurde ein Review-Artikel veröffentlicht, der Anfängern auf diesem Gebiet die Grundlagen erläutert. Die Herausforderung einer ausreichenden Fragmentierung bei der Top-down-Proteinanalyse wurde ebenfalls in einem Unterkapitel behandelt. Im letzten Teil der Arbeit wird eine Anwendung der Methoden für die Grundlagenforschung auf dem Gebiet der Alzheimer-Demenz vorgestellt. Auch hier spielen verschiedene Proteoformen des Amyloid β-Peptids eine wesentliche Rolle bei der Erkrankung und ihrem Verlauf. Native Massenspektrometrie in Kombination mit Ionenmobilität wurde eingesetzt, um die Unterschiede zwischen diesen Proteoformen zu untersuchen und ihre Wechselwirkungen besser zu verstehen. Zusammenfassend zielt diese Arbeit darauf ab, die Möglichkeiten und Chancen der nativen Massenspektrometrie, der Top-down-Proteinanalyse und der Ionenmobilität und vor allem ihre Anwendung bei der Proteincharakterisierung aufzuzeigen.