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Analyse von schnellen dynamischen Prozessen und Proteininteraktionen nach dicht ionisierender Bestrahlung

Tobias, Frank :
Analyse von schnellen dynamischen Prozessen und Proteininteraktionen nach dicht ionisierender Bestrahlung.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2012)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Analyse von schnellen dynamischen Prozessen und Proteininteraktionen nach dicht ionisierender Bestrahlung
Language: German
Abstract:

Ziel dieser Arbeit war die Dynamik und die Bindungseigenschaften von DNA-Reparaturproteinen in der Reaktion lebender humaner Zellen auf strahleninduzierte DNA-Schäden zu untersuchen. Insbesondere sollte der Einfluss der hohen DNA-Schadensdichte nach Schwerionenbestrahlung analysiert werden. Mittels verschiedener Mikroskopietechniken wurde die Geschwindigkeit der Akkumulation und der Austausch der DNA Reparaturproteine NBS1, MDC1, ATM, ATR und 53BP1 in strahleninduzierten Foci ermittelt. Durch kinetische Modellierungen konnten Bindungsparameter bestimmt werden. Untersuchungen in unbestrahlten Zellen zeigten für alle Proteine im Zellkern eine unterschiedliche und gleichzeitig deutlich geringere Mobilität, als gemäß reinem Diffusionsverhalten zu erwarten gewesen wäre. Alle Proteine zeigten außerdem eine funktionsabhängige Rekrutierungskinetik. 53BP1 bindet schadensdichteunabhängig an das Chromatin um den DNA Schaden. Hierbei bildet die Gesamtproteinmenge den kinetisch limitierenden Faktor. NBS1 bindet in zwei Fraktionen an den DNA-Schaden, wobei mit steigender Schadensdichte der fest bindende Anteil zunimmt. Auch das Protein ATR bindet vermehrt bei einer hohen Schadensdichte. Die stark konzentrierte und komplexe DNA-Schädigung nach Schwerionenbestrahlung und die vermehrte feste Bindung von NBS1 führen vermutlich zu einer erhöhten Proteinaktivierung. Dadurch werden im umliegenden Chromatin beschleunigt Bindungsstellen gebildet, was in einer schnelleren Akkumulation von MDC1 zusammen mit NBS1 resultiert. Eine sehr hohe Schadensdichte führt außerdem dazu, dass MDC1 nicht nur direkt um den DNA Schaden, sondern auch an das Chromatin im gesamten Zellkern bindet. Diese Ergebnisse zeugen von einer veränderten Zellreaktion nach Bestrahlung mit Schwerionen und verdeutlichen die besondere biologische Wirkung der Schwerionenbestrahlung.

Im zweiten Projekt sollte ein experimenteller Aufbau entwickelt werden, der es ermöglicht die Interaktion von Molekülen in lebenden Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu messen. Dieser Aufbau soll in Zukunft dazu dienen, das komplexe molekulare Netzwerk der zellulären Antwort auf DNA-Schäden besser erforschen zu können. Hierzu wurde die fluoreszenzpolarisationsbasierte FRET Messmethode erstmals mit konfokaler Spinning-Disk Mikroskopie kombiniert. Durch einen modularen Aufbau ist das System auch weiterhin als konfokales Fluoreszenzmikroskop verwendbar. Das FRET System wurde mit blau/gelb und rot/grün fluoreszierenden Referenzstandards validiert und in ersten biologischen Anwendungen getestet.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The aim of this project was to analyze the dynamics and binding characteristics of DNA repair proteins during the response of living human cells to radiation-induced DNA damage. In particular, the impact of dense DNA damage after charged particle irradiation was investigated. Different microscopic techniques were used to determine the accumulation kinetics and exchange rates of the repair proteins NBS1, MDC1, ATM, ATR and 53BP1 in irradiation-induced foci. By applying kinetic models, binding constants could be identified. In unirradiated cells, all proteins behaved differently and were less mobile than expected from pure diffusion. Furthermore, all proteins showed function-dependent accumulation kinetics. Binding of 53BP1 to the chromatin surrounding the DNA damage is independent of the damage density. The amount of protein is the kinetically limiting factor. NBS1 binds in two distinct fractions to the damaged DNA in which the tight binding fraction grows with increasing DNA damage density. The amount of ATR which binds to the damaged DNA also increases with the damage density. The highly concentrated and complex DNA damage after charged particle irradiation together with the increased tight binding fraction of NBS1 presumably results in stronger protein activation. Consequently, the creation of binding sites in the damaged area surrounding chromatin is accelerated and MDC1 together with NBS1 is recruited faster. A high damage density also results in the binding of MDC1 not only to the chromatin in the damaged area but also throughout the entire cell nucleus. These results are evidence of an altered cellular response after irradiation with charged particles and point out the specific biological effects of charged particle irradiation. In a second project, an experimental setup was designed that makes it possible to measure molecular interactions in living cells with high spatial and temporal resolution. This setup will provide insights in the complex molecular network within cells after DNA damage induction. The fluorescence polarization-based FRET method was combined with a spinning disk confocal microscope for the first time. Through a modular design, the system still provides a conventional setup for confocal fluorescence microscopy. The FRET system was validated with blue/yellow and green/red fluorescence reference standards and was used in preliminary biological experiments.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
Divisions: Fachbereich Physik
Date Deposited: 21 Mar 2012 14:51
Last Modified: 07 Dec 2012 12:04
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-29217
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Durante, Prof. Ph.D Marco and Gerhard, Prof. Dr. Kraft
Refereed: 13 February 2012
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2921
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