TU Darmstadt / ULB / tuprints

Chemoenzymatische Synthese funktioneller Sialokonjugate

He, Ning :
Chemoenzymatische Synthese funktioneller Sialokonjugate.
TU Darmstadt/Chemie, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2012)

[img]
Preview
PDF
Doktorarbeit-Ning_He.pdf
Available under Creative Commons Attribution Non-commercial No Derivatives.

Download (5Mb) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Chemoenzymatische Synthese funktioneller Sialokonjugate
Language: German
Abstract:

Sialinsäuren, eine große Familie von 9-Kohlenstoff-Zuckern mit einer α-Ketonsäurefunktionalität, spielen direkt oder indirekt in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen eine essentielle Rolle. Um die biologische Bedeutung von unterschiedlichen Sialinsäuren und Sialokonjugaten in der Natur zu verstehen bzw. neuartige pharmazeutische Ansätze zu entwickeln, ist die Verbesserung der Methodik der enzymatischen Aktivierung bzw. des Sialyltransfers auf der Basis neuer, gut zugänglicher Enzyme bzw. deren Anwendungsperspektiven für die präparative Beschaffung neuartiger Sialokonjugate ein wichtiger Schritt. Da Sialylglycokonjugate generell entweder aus natürlichen Quellen extrem schwer zu isolieren oder chemisch ineffizient zu sythetisieren sind, kommt enzymatischen Synthesemethoden eine Schlüsselrolle zu. Durch Kombination der Flexibilität von chemischen Methoden mit der hohen Effizienz der N-Acetylneuraminsäure-Aldolase (NeuA) wurden hier verschiedene Sialinsäuren synthetisiert. Die Cytosin-5‘-monophosphat-Sialat-Synthetase (CSS) aus Neisseria meningitidis (Nm.) wurde bereits in vielen Arbeiten für die Aktivierung unterschiedlicher nicht-natürlicher Sialinsäuren verwendet. Ergänzend wurde in dieser Arbeit eine kinetische Quantifizierung der CSS-Wildtyp und von 6 active site-Mutanten mittels einer neu entwickelten sensitiven kontinuierlichen pH-Assay-Methode für verschiedene Sialinsäurederivate und Analoga untersucht. Mit Hilfe von α2,3-Sialyltransferase (α2,3-SiaT) aus Campylobacter jejuni (CstII Δ32) oder α2,6-SiaT aus Photobacterium Leiognathi JT-SHIZ-145 (Pl.) wurden die neuartigen Sialokonjugate aus den verschiedenen quantitativ in situ aktivierten Sialinsäuren und einem Sialyltransferase-Akzeptor für die Bestätigung der kinetischen Resultate bzw. eine vollständige Charakterisierung präparativ hergestellt. Die Visualisierung biologischer Phänomene mit Hilfe von Fluoreszenzmarkern ist eine sehr attraktive Methode im Forschungsbereich der chemischen Biologie. Fluoreszenzmarkierung von Sialinsäuren auf Zelloberflächen können diese biologischen Phänomene mittels Fluoreszenzmikroskopie in räumlicher Auflösung visualisieren. Für diesen Zweck wurden in dieser Arbeit die Synthesen von verschiedenen CMP-aktivierten fluoreszenzverlinkten Sialinsäuren für biologische Studien optimiert. Außerdem konnten im Rahmen dieser Arbeit neuartige Pseudo-Oligosaccharide mit sich wiederholenden Sialyllactose-Einheiten aus CSS-aktivierbaren Sialylakzeptor-gekoppelten Sialinsäuren erstmals auf rein enzymatischem Weg mit Hilfe der Kopplung von CSS aus Nm. und α2,6-SiaT aus Pl. nach einer Eintopf/zwei-Enzym-Strategie herstellt werden. Sowohl einfach, als auch doppelt fluoreszenzmarkierte Produkte sind mit dieser Strategie gezielt herstellbar.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Sialic acids, a diverse family of acidic 9-carbon sugars, play important roles directly or indirectly in a variety of physiological and pathological processes. In order to understand the biological importance of the different sialic acids, sialoconjugates in nature and also to develop the novel therauptic targets, improvement in the methodology of enzymatic activation, sialyltransfer based on the novel, well accessible enzymes and accordingly application of perspective for the preparative synthesis of novel sialoconjugates are immensely important. We have synthesized different sialic acids by the combination of chemical flexibility and the high efficiency of the N-Acetylneuraminsäure-Aldolase (NeuA). The cytosine-5‘-monophosphate-acetylneuraminate synthetase (CSS) from Neisseria meningitides (Nm.) was used to active non-natural sialic acids. We have successfully established a simple continuous colorimetric assay for the sensitive and reliable quantification of CSS activity based on the pH change of a released proton. Using this method, kinetic data of the CSS-wildtype and 6 active site-mutants was determined for different structural variations of the sialic acids, which were used for the preparation of neo-sialoconjugate analogs of 2,3/8-Sialyllactose and 2,6-Sialyllactose in a one-pot two-enzyme cascade by CSS from Nm. together with Hilfe von α2,3-Sialyltransferase (α2,3-SiaT) from Campylobacter jejuni (CstII Δ32) oder α2,6-SiaT from Photobacterium Leiognathi JT-SHIZ-145 (Pl). Visualization of biological phenomena with the aid of fluorescent markers has emerged as an exciting challenge for chemical biologists. Thus, the synthesis of fluorescently labelled sialic acids and their transfer to biological structures are attractive targets. For this purpose, we have optimized the synthesis of the various CMP-activated fluorescent sialic acids. Furthermore, we report the first successful example of glycosyltransferase-catalyzed polymerization yielding structurally defined poly¬saccharides with internal sialic acid residues. We have found that the sialic acids with N-acyl-linked lactosyl units after efficient activation by the CSS from Nm. can be trans¬ferred repetitively by the α2,6-SiaT from Pl. to yield neo-glycopolysaccharides containing internal sialyllactoside repeating units, respectively, thus mimicking naturally occurring polysaccharides.English
Place of Publication: Darmstadt
Uncontrolled Keywords: Sialinsäure, pH-Assay-Methode, Cytosin-5‘-monophosphat-Sialat-Synthetase, α2,3-Sialyltransferase, α2,6-Sialyltransferase, Fluoreszenzmarkierung, Pseudo-Oligosaccharide mit sich wiederholenden Sialyllactose-Einheiten, Eintopf/zwei-Enzym-Strategie
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: Fachbereich Chemie > Organische Chemie
Date Deposited: 23 Mar 2012 10:59
Last Modified: 07 Dec 2012 12:04
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-29184
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Fessner, Prof. Dr. Wolf-Dieter and Kolmar, Prof. Dr. Harald
Refereed: 12 December 2011
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2918
Export:

Actions (login required)

View Item View Item