TU Darmstadt / ULB / tuprints

Der Beitrag des Nicht-Homologen End-Joining (NHEJ) bzw. der Homologen Rekombination (HR) zur Reparatur von strahleninduzierten DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs)

Njoke A Biaka, Léopoldine Estelle :
Der Beitrag des Nicht-Homologen End-Joining (NHEJ) bzw. der Homologen Rekombination (HR) zur Reparatur von strahleninduzierten DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs).
Institut für Zoologie
[Ph.D. Thesis], (2010)

[img]
Preview
Dissertation - PDF
Doktorarbeit_Leo.pdf
Available under Simple publication rights for ULB.

Download (8Mb) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Der Beitrag des Nicht-Homologen End-Joining (NHEJ) bzw. der Homologen Rekombination (HR) zur Reparatur von strahleninduzierten DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs)
Language: German
Abstract:

In dieser Arbeit wurde die DSB-Reparatur von Wildtyp-Zellen und Zellen, die Defizienzen für bestimmte Reparaturproteine aufweisen, in der G1- und G2-Phase analysiert. Dafür wurde die γH2AX-Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, die erlaubt DSBs nach geringen Dosen ionisierender Strahlung sichtbar zu machen. Diese γH2AX-Analyse, kombiniert mit Zellzyklusmarker hat ermöglicht, das Reparaturverhalten in zwei verchiedenen Zellzyklusphasen innerhalb der Zellpopulation zu studieren und zu vergleichen. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der DSB-Reparaturanalyse von ATM-, Artemis-, MDC-1- und 53BP1-defizienten Zellen. Beide Proteine ATM und Artemis wurden als Faktoren des NHEJ-Reparaturwegs beschrieben, da sie in konfluenten Zellen (G0-Zellen) einen kleinen und identischen Reparaturweg aufweisen. Sie werden nur bei 10–15 % aller durch ionisierende Strahlung erzeugten DSBs benötigt (Riballo et al., 2004). Es stellte sich nun die Frage, inwieweit der ATM- und Artemis-abhängige Reparaturweg eine Rolle in aktiv proliferierenden Zellen spielt. ATM und Artemis zeigen in der G1- und G2-Phase einen kleinen und ähnlichen Reparaturdefekt. Etwa 15 % der DSBs bleiben im Vergleich zu WT-Zellen unrepariert. Die doppelte Depletion von ATM und Artemis in HeLa-Zellen mittels siRNA bewirkt, sowohl in der G1- als auch G2-Phase, keine Verdoppelung des Reparaturdefekts, verglichen zu den einzelnen ATM- und Artemis-Depletionen. Dies zeigt, dass ATM und Artemis in beiden Zellzyklusphasen im gleichen Reparaturweg wirken. Interessanterweise zeigen MDC-1- und 53BP1-defizienten Zellen einen ähnlichen Reparaturdefekt wie ATM- und Artemis-defiziente Zellen in der G1- und G2-Phase. Epistasis Studien mit dem ATM-Inhibitor zeigen, dass MDC-1 und 53BP1 an dem ATM-abhängigen Reparaturweg in der G1- und G2-Phase beteiligt sind. Diese Ergebnisse beweisen, dass MDC-1 und 53BP1 Komponente des NHEJ in der G1-Phase sind. Erstaunlicherweise entspricht der ATM-, Artemis-, MDC-1- und 53BP1-Reparaturdefekt demjenige, der in HR-Mutanten beobachtet wurde. Dies warf die Frage auf, ob ATM, Artemis, MDC-1 und 53BP1 in der G2-Phase ebenfalls dem NHEJ-Reparaturweg zugehören, oder möglicherweise eine Funktion in der HR erfüllen. Um diese Frage näher zu untersuchen, wurden ATM und DNA-PKcs in HR-defizienten Zellen inhibiert. Beide Inhibitionen verursachen einen Reparaturdefekt in der G1-Phase in HR-defizienten Zellen. Dagegen verursacht nur die Inhibition des DNA-PKcs eine Erhöhung des HR-Reparaturdefekts in der G2-Phase. Die Inhibition von ATM hat keinen Einfluss auf das Reparaturverhalten von HR-Mutanten in der G2-Phase. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ATM und HR-Proteine an der gleichen Reparaturweg in der G2-Phase beteiligt sind. Dies läßt vermuten, dass ATM womöglich eine Rolle in der HR spielt. Unterstützt wurde diese Hypothese durch die Inhibition von ATM und DNA-PKcs in NHEJ-defizienten Zellen. Während Defizienzen in ATM und DNA-PKcs zu keiner weiteren Erhöhung des NHEJ-Reparaturdefekts in der G1-Phase führt, ist in G2-Zellen eine Erhöhung des NHEJ-Reparaturdefekts bei der ATM-, nicht aber bei der DNA-PKcs-Inhibition zu erkennen. Dadurch scheint ATM zwei unterschiedliche Funktionen in der DSB-Reparatur zu übernehmen, die abhängig von der Zellzyklusphase sind. Eine direkte Beteiligung von Artemis, 53BP1 und MDC-1 an der HR wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht nachgewiesen. Da diese Proteine an dem ATM-abhängigen Reparaturweg in der G2-Phase beteiligt sind, ist es durchaus vorstellbar, dass sie auch in der G2-Phase Komponente der HR sind. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der DSB-Reparaturanalyse von NHEJ (Nicht-Homologe End-Joining)- und HR (Homologe Rekombination)-Mutanten. Erwartungsgemäß zeigen NHEJ-Mutanten einen starken Reparaturdefekt in der G1-Phase, wo NHEJ der Hauptreparaturweg ist. Erstaunlicherweise zeigen diese Mutanten auch einen starken Reparaturdefekt in der G2-Phase, wo die HR doch als alternativer Reparaturweg neben NHEJ zur Verfügung steht. Mehr als 50 % der DSBs bleiben innerhalb der ersten 4 h nach Bestrahlung in der G1- und G2-Phase bei NHEJ-Mutanten unrepariert. Dementsprechend zeigen HR-Mutanten einen weitaus geringeren Reparaturdefekt als NHEJ-Mutanten in der G2-Phase. Dieser Defekt wird erst ab 4 h nach Bestrahlung zunehmend sichtbar. Nur 15 % der DSBs bleiben innerhalb der letzten vier Stunden nach Bestrahlung erhalten. Erwartungsgemäß zeigen HR-Mutanten ein ähnliches Reparaturverhalten wie WT-Zellen in der G1-Phase, da sie über ein funktionelles NHEJ verfügen. Diese Ergebnisse beweisen, dass NHEJ ein schneller Reparaturprozess ist, und für die Mehrheit der DSBs in der G1- und G2-Phase benötigt wird. Dagegen läuft die HR eher langsam und wird nur für eine Untermenge an DSBs benötigt. Anschließend wurde die DSB-Reparatur von verschiedenen NHEJ/HR-Doppelmutanten analysiert. Die Ergebnisse sind teilweise widersprüchlich. Während Defizienzen in beiden Hauptreparaturwegen in einigen Doppelmutanten zu einem Reparaturdefekt führt, der sich aus den einzelnen NHEJ- und HR-Defekten in der G2-Phase zusammenaddiert, ist es bei anderen Mutanten nicht der Fall gewesen. Stattdessen weisen diese Doppelmutanten ein ähnliches Reparaturverhalten wie NHEJ-Mutanten in der G2-Phase auf, als ob die zusätzliche Inaktivierung der HR keinen Einfluss hätte. Aufgrunddessen konnte in dieser Arbeit nicht eindeutig demonstriert werden, dass NHEJ und HR in der G2-Phase additiv sind. Zukünftige Experimente sollen durchgeführt werden, um die Funktion von ATM und ATM-Epistasisproteine in der HR näher zu charakterisieren. Außerdem sollten die Mechanismen geklärt werden, die für die Wahl des Reparaturwegs in der G2-Phase entscheidend sind.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The aim of this work was the analysis of the double strand break repair in wt cells and in cells, which have a mutation for some repair proteins of interest. This analysis was carried out in the G1 and G2 phase of the cell cycle. The γH2AX-immunofluorescence microscopy was used for the detection of DSBs. This method allows the visibility of DSBs, even after low doses of ionizing radiation. Combined with specific cell cycle markers the γH2AX-analysis has made it possible to study and to compare the repair behavior of G1 and G2 cells within the same cell population. The first part of the work deals with the double strand break repair in ATM, Artemis, MDC-1 und 53BP1 mutants. Both proteins ATM and Artemis have been described as factors of the NHEJ repair pathway. In fact they show a small and similar repair defect in the G0 phase. Both proteins are only required for the repair of a subset (10-15 %) of IR-induced DSBs (Riballo et al., 2004). It was now of interest to investigate the role of the ATM and Artemis dependent repair in proliferating cells. ATM and Artemis deficient cells show in G1 and in G2 a similar repair defect like in G0. About 15 % of DSBs remain unrepaired. ATM/Artemis double depleted HeLa cells do repair their DSBs nearly as efficiently as the ATM and Artemis depleted cells alone. This shows that ATM and Artemis work in both phases in the same repair pathway. Interestingly the repair defect observed in MDC-1 and 53BP1 mutants is similar to that of the ATM and Artemis mutants. Epistasis studies with the ATM inhibitor show that 53BP1 and MDC1 are involved in the ATM dependent repair in G1 and G2. These results demonstrate that MDC-1 and 53BP1 are factors of NHEJ in G1. Interestingly, the ATM and Artemis repair defect and therefore this of MDC-1 and 53BP1 are the same as this, which is also observed in HR mutants. This raised the question of whether ATM and Artemis also belong to the NHEJ pathway in the G2 phase, or might fulfill a function in the HR. To answer this question, epistasis studies with both ATM and DNA-PKcs inhibitors were performed in NHEJ and HR mutants. The use of the specific ATM and DNA-PKcs inhibitors in HR deficient cells shows that ATM and the HR proteins are involved in the same repair pathway in G2. In fact the inhibition of ATM and DNA-PKcs causes a repair defect in HR mutants in G1, whereas only the inhibition von DNA-PKcs does increase the HR repair defect in G2. The inhibition of ATM doesn’t affect the repair behavior of HR mutants. These results suggest that ATM might assume a role in HR in G2. The results, which are obtained after the inhibition of DNA-PKcs and ATM in NHEJ-deficient cells do support this hypothesis. In fact the inhibition of DNA-PKs and ATM in the NHEJ mutants doesn’t increase their strong repair defect in G1, whereas an additional repair defect was recognized after the ATM but not the DNA-PKcs inhibition in G2. According to these results ATM appears to have two different functions in the DSB repair, dependent of the cell cycle phase. A function of the proteins Artemis, MDC-1 and 53BP1 was in this work not demonstrated. Since these proteins belong to the ATM epistasis group in G1 and G2, it might be conceivable that they are factors of the HR in G2 like ATM. The second part of the work deals with the double strand break repair of NHEJ (non homologous end joining) and HR (homologous recombination) mutants. As expected NHEJ mutants show a strong repair defect in the G1 phase, as NHEJ is the main repair pathway in G1. Surprisingly, these mutants show too a similarly strong repair defect in the G2 phase, where HR is available as an alternative repair pathway to NHEJ. More than 50 % of the DSBs remain within the first four hours post irradiation unrepaired. These results demonstrate that NHEJ plays a dominant role in G2. Accordingly, HR mutants show a much lower repair defect compared to that of NHEJ mutants in G2. The HR repair defect is becoming increasingly visible from four hours post irradiation. About 15 % der DSBs remain unrepaired. As expected HR mutants show a similar repair efficiency to that of wild type cells in G1, as the HR is suppressed there. In conclusion the majority of DSBs is repaired quickly through the NHEJ repair pathway. The last part of the work deals with the DSB repair of NHEJ/HR double mutants. The obtained results are partially contradictory. Some double mutants show an additive repair defect in G2 as to be expected and the other don’t. Instead, these double mutants show an similar repair behavior like NHEJ mutants, suggesting that the HR inactivation doesn’t have any effect. Thus it could not be concluded clearly in this work that NHEJ and HR are additive in G2. Further experiments need to be carried out to characterize closer the function of ATM and ATM epistasis proteins in the HR repair pathway and to determine under which conditions the two main repair mechanisms NHEJ and HR may interact with each other.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 29 Dec 2010 11:00
Last Modified: 07 Dec 2012 11:58
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-23737
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Löbrich, Prof. Dr. Markus and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 17 December 2010
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2373
Export:

Actions (login required)

View Item View Item