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Untersuchungen zur Regulation des G1/S-Checkpoints

Koch, Barbara :
Untersuchungen zur Regulation des G1/S-Checkpoints.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2010)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Untersuchungen zur Regulation des G1/S-Checkpoints
Language: German
Abstract:

Für die Erhaltung der genomischen Integrität ist das Zusammenspiel von Zellzykluskontrolle und DNA-Reparatur nach Auftreten von Doppelstrangbrüchen (DSBs) oder andersartigen Schäden wesentlich. Um der Zelle Zeit zur Reparatur der DNA-Schäden zur Verfügung zu stellen, werden Checkpoints zur Verlangsamung oder Inhibierung der Proliferation induziert. Es wurde beobachtet, dass der G2/M-Checkpoint eher insensitiv gegenüber DSBs ist und Zellen vor Abschluss der Reparatur in die Mitose entlässt. Der G1/S-Checkpoint ist dagegen als ein sehr sensitiver Checkpoint beschrieben, der als sogenannter „Master-Checkpoint“ über eine weitere Proliferation oder einen dauerhaften G1-Arrest der Zellen entscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der G1/S-Checkpoint nach ionisierender Strahlung (IR) auf zellulärer Ebene genauer charakterisiert werden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde daher zunächst die zeitliche Regulierung des G1/S-Checkpoints und die Sensitivität in Bezug auf DSBs untersucht. Mit der neu etablierten Methode der Lebend-zellmikroskopie oder des „Live Cell Imagings“ können Zeitrafferaufnahmen lebender Zellpopulationen erstellt werden. Die Transfektion humaner Fibroblasten mit GFP-53BP1 erlaubte die Quantifizierung von DSBs, während anhand der unterschiedlichen nukleären Lokalisation von RFP-LigaseI die Abgrenzung von G1- zu S-Phase-Zellen erfolgte. Mit Hilfe dieser Methode wurde gezeigt, dass in der G1-Phase mit 1 Gy bestrahlte Zellen innerhalb der ersten 6 h mit 10 bis 16 DSBs in die S-Phase progressierten, bis der G1/S-Checkpoint voll einsetzte. Die Verfolgung einzelner GFP-53BP1-Foci durch die S-Phase führte zu dem Ergebnis, dass strahleninduzierte DSBs im Laufe der S-Phase größtenteils repariert wurden. Gleichzeitig konnte die Entstehung und der kontinuierliche Anstieg replikationsassoziierter DSBs während der S-Phase beobachtet werden. Zur Verifizierung dieser überraschenden Ergebnisse wurde mittels fixierter Zellen und „klassischer“ Methoden, wie Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz-Mikroskopie, nach Bestrahlung von G1-Zellen ebenfalls die Dauer bis zum Einsetzen eines G1-Arrests bestimmt. Dabei zeigte sich, dass es während der ersten Stunden auch nach hohen Dosen nur zu einer Verlangsamung beim Eintritt in die S-Phase kommt. Ein vollständiger G1-Arrest trat erst 4 h bis 6 h nach Bestrahlung ein. Die gleichzeitige Messung der -H2AX-Foci als Marker für DSBs zeigte, dass bis zu diesem Zeitpunkt Zellen, unabhängig von der Bestrahlungsdosis, mit unreparierten DSBs in die S-Phase gelangten. Nach dem Einsetzen zeigte sich der Checkpoint allerdings sehr sensitiv. Die Dauer des Arrests war hierbei abhängig von der Bestrahlungsdosis, und der Arrest wurde erst wieder aufgehoben, wenn die Zellen nur noch wenige DSBs aufwiesen. Die bisherigen Ergebnisse zur Charakterisierung des G1/S-Checkpoints zeigten verschiedene Limitierungen auf, die mit der Vorstellung eines „Master-Checkpoints“ zumindest im ersten Zellzyklus nach Bestrahlung nicht unbedingt vereinbar sind. Das langsame Einsetzen des G1/S-Checkpoints deutete auf eine ineffektive DSB-Schadensantwort hin und warf die Frage nach den molekularen Mechanismen auf. Daher wurde im zweiten Teil der Arbeit die Regulation des G1/S-Checkpoints nach Modifikation des DNA-Schadens und der somit aktivierten Schadensantwort untersucht. Während nach IR DSBs induziert werden, deren Detektion vornehmlich über ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) verläuft, entstehen durch die Bestrahlung mit kurzwelligem (254 nm), monochromatischem UVC-Licht vor allem Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere (CPDs) und 6-4-Photoprodukte (6-4PPs) an der DNA. Im Zuge der Reparatur entstehen einzelsträngige Bereiche, welche als Aktivierungs-Signal von ATR dienen könnten. Um die Abhängigkeit des Checkpoints von ATM und ATR zu untersuchen, wurde neben einer WT-Zellline auch eine ATM- und ATR-defiziente Zellline eingesetzt. Zum direkten Vergleich der Regulation nach IR und UVC-Bestrahlung wurden ebenfalls die Methoden der Durchflusszytometrie und der Immunfluoreszenz-Mikroskopie verwendet. Exponentiell wachsende Zellen arretierten im Gegensatz zu IR nach UVC-Bestrahlung direkt am G1/S-Übergang. Zudem war keine Abhängigkeit von ATM und ATR erkennbar. Da auch S-Phase-Zellen sofort nach UVC-Bestrahlung arretierten, konnte nicht ausgeschlossen werden, dass die Induktion des G1/S-Checkpoints eventuell von Intra-S-Phase-Checkpoints und/oder mechanischer Inhibierung beeinflusst wurde. Dies sollte durch die Bestrahlung von synchronisierten Zellen in der frühen G1-Phase umgangen werden. Nach Stimulation und Bestrahlung der Zellen ergab sich keine direkte Abhängigkeit des G1/S-Checkpoints von ATR, und es waren nur leichte Effekte von ATM erkennbar. Die erhaltenen Daten sprechen für die Beteiligung einer oder mehrerer weiterer Komponenten, die im Signaling des G1/S-Checkpoints involviert sind. Da bekannt ist, dass der G2/M-Checkpoint im Gegensatz zum G1/S-Checkpoint nach IR sehr schnell einsetzt, wurde abschließend dessen Abhängigkeit von ATM und ATR nach IR und UVC-Bestrahlung untersucht, um eventuelle Unterschiede im Signaling der beiden Checkpoints aufzudecken. Erwartungsgemäß konnte in ATM-profizienten Zellen nach IR, sowie in ATR-profizienten Zellen nach UVC-Bestrahlung innerhalb einer Stunde ein G2/M-Checkpoint induziert werden. Die ATR-defiziente Zelllinie wies nach UVC-Bestrahlung ein geringes, fluenzabhängiges Einsetzen des Checkpoints auf. Bei Inhibierung von ATM wurde nach IR in allen Zelllinien ein vollständiges Aufheben des Checkpoints beobachtet, während dies nach UVC-Bestrahlung nur in ATR-defizienten Zellen beobachtet werden konnte. Diese Ergebnisse gaben Grund zur Annahme, dass nach UVC-Bestrahlung sowohl ATR als auch ATM an einem Signaling zur Induktion des G2/M-Checkpoints nach UVC-Bestrahlung beteiligt sind. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nach UVC-Bestrahlung ein von ATM und ATR abhängiger G2/M-Checkpoint innerhalb einer Stunde beobachtet werden. Nach den unerwarteten Ergebnissen eines langsam einsetzenden G1/S-Checkpoints nach IR wurde nach UVC-Bestrahlung ein schnell einsetzender G1/S-Checkpoint nachgewiesen, bei dem keine direkte ATR-Abhängigkeit und eine leichte ATM-Abhängigkeit festgestellt wurden. Ob allerdings weitere Faktoren zur vollständigen Initialisierung vonnöten sind, muss in folgenden Arbeiten geklärt werden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
After the appearance of DNA double-strand breaks (DSBs) or other lesions, the coordinated inter-play between cell cycle control and DNA repair is essential for the maintenance of the genomic integrity. To provide time for the repair of the DSBs, activated checkpoints slow down or halt the cell cycle progression of the cells. It has been observed that the G2/M checkpoint is insensitive to DSBs and releases cells into mitosis before DSB repair has been completed. In contrast, the G1/S checkpoint is described to be very sensitive and is assumed to be a “master checkpoint” which decides whether a cell should divide or undergo a permanent cell cycle arrest. So, this work addresses the characterization of the G1/S checkpoint on the cellular level after ionizing radiation (IR). The first part of the work deals with the temporal regulation of the G1/S checkpoint and the sensi-tivity with regard to DSBs. The new established method of Live Cell Imaging allows the observation of living cells over long time periods. Transfection of human fibroblasts with constructs encoding for GFP-53BP1 allows the quantification of DSBs. The discrimination of G1 and S phase cells was done by the different pattern of co-transfected RFP-LigaseI. By means of this method, a progression of irradiated cells into the S phase with 10-16 DSBs could be demonstrated within the first 6 h until the activation of the G1/S checkpoint. Tracing of single DSBs uncovered that during S phase IR-induced DSBs are repaired for the most part. Simultaneously, a continuous increase of replication-associated DSBs could be observed during S phase. By using fixed cells and “classical” methods like flow-cytometry and immunfluorescence-microscopy, these astonishing results could be verified. During the first hours only a slowing of S phase entry occurs even after high doses and a full G1 arrest only takes place 4 h to 6 h after IR. The simultaneous measurement of -H2AX-foci as a DSB-marker demonstrates that during this time cells enter S phase with unrepaired DSBs and that this process is dose-independent. But once activated, the G1/S checkpoint is very sensitive. The duration of the arrest depended on the irradiation dose and the arrest was not abrogated until cells have repaired nearly to background level. These results uncovered different limitations of the G1/S checkpoint, which are not compatible with the association of a “master checkpoint” – at least in the first cell cycle after irradiation. The slow activation of the G1/S checkpoint points to an ineffective DSB damage response and it raises the question for the molecular mechanisms. Thus, in the second part of this work the regulation of the G1/S checkpoint after modification of the DNA damage and the activated damage response was investigated. While IR induces DSBs which are detected by ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated), short-wave (254 nm), monochromatic UVC-light induces Cyclobutan-Pyrimidin-Dimers (CPDs) and 6-4-Photoproducts (6-4PPs). In the course of repair ssDNA regions are created which might serve as a signal for the activation of ATR. To investigate the dependency of the G1/S checkpoint on ATM and ATR, additional to wt cells, an ATM-deficient and an ATR-deficient cell line were used in the experiments. For the direct comparison with IR, the methods of flow-cytometry an immunfluorescence-microscopy were utilized. In contrast to IR, after UVC-irradiation a G1/S checkpoint arrest of exponential growing cells was immediately detected. Furthermore, no dependency of the checkpoint on ATM and ATR was detectable. Because of the immediate arrest of S phase cells after UVC-irradiation, it could not be excluded that the induction of the G1/S checkpoint is probably affected by Intra-S checkpoints or mechanical inhibition of replication forks. To exclude these possibilities, synchronized G1 phase cells were irradiated directly after release. In these cells no direct depen-dency on ATR and only little effects of ATM could be identified. These data indicate an additional involvement of one or multiple factors in the signaling of the G1/S checkpoint. As it is known, the G2/M checkpoint is in contrast to the G1/S checkpoint activated within 1 h after IR. So finally its dependency on ATM and ATR was investigated after IR and UVC-irradiation. As expected, a G2/M checkpoint could be induced in ATM-proficient cells after IR and in ATR-proficient cells after UVC. The ATR-deficient cell line showed a marginal fluence-dependent activation of the checkpoint after UVC-irradiation. After IR, ATM-inhibition lead to a complete abrogation of the G2/M checkpoint indicating a G2/M checkpoint solely on ATM. Interestingly, after UVC-irradiation ATM-inhibition lead to a weaker G2/M checkpoint induction in wt cells and to a complete checkpoint abrogation in ATR-deficient cells. This demonstrates that both kinases, ATM and ATR, are involved in G2/M checkpoint regulation after UVC-treatment. Summarizing, a G2/M checkpoint dependency of ATM and ATR could be detected within an hour after UVC-irradiation. After the unexpected results of a slowly activated G1/S checkpoint after IR, a fast induced G1/S checkpoint could be detected after UVC-irradiation, without direct dependency of ATR and only a low dependency of ATM. The participation of additional components for entire checkpoint activation has to be verified in further studies.English
Uncontrolled Keywords: G1/S-Checkpoint, ATM, ATR, Live Cell Imaging
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
G1/S-Checkpoint, ATM, ATR, Live Cell ImagingGerman
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 13 Dec 2010 11:46
Last Modified: 07 Dec 2012 11:58
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-23634
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Löbrich, Prof. Dr. Markus and Warzecha, Prof. Dr. Heribert
Refereed: 7 December 2010
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2363
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