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Neue Wege zur rekombinanten Oligomerisierung von Peptiden und Proteine über den mitochondrialen Tim10/Tim9-Komplex

Daneschdar, Matin :
Neue Wege zur rekombinanten Oligomerisierung von Peptiden und Proteine über den mitochondrialen Tim10/Tim9-Komplex.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2010)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Neue Wege zur rekombinanten Oligomerisierung von Peptiden und Proteine über den mitochondrialen Tim10/Tim9-Komplex
Language: German
Abstract:

Das Ziel dieser Arbeit war der Aufbau und die Etablierung eines rekombinanten Oligomerisierungsverfahrens von Peptiden und kleinen Proteinen über den mitochondrialen Tim10/Tim9‐Komplex. Das System sollte in Hinsicht auf die Generierung bispezifischer Oligomere, der Oligomerisierung von Proteinen, der Bindung und Modulation pharmazeutisch relevanter Rezeptoren und der chemischen Funktionalisierung untersucht werden. Im ersten Abschnitt der Arbeit erfolgte der Aufbau eines robusten Expressionsystems zur Bereitstellung funktionaliserter Tim10/9‐Komplexe. Es war möglich sowohl ein bicistronisches als auch ein duales Expressionssystem zu etablieren. Beide Systeme stellten funktionalisierte Tim10/Tim9‐Komplexe für weitere Analysen in ausreichender Mengen bereit. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Integrität der hexameren Struktur bei N‐ oder C‐terminaler Fusion einer Passagierdomäne an die Tim9‐ oder Tim10‐Untereinheit erhalten bleibt. Der zweite Abschnitt beschäftigte sich mit der Generierung biofunktionaler Tim10/Tim9‐Komplexe. Dabei war es möglich sowohl pseudozyklische Peptide, als auch Cystin‐Knoten‐Mikroproteine über Fusion an den Tim10/Tim9‐Komplex zu oligomeriseren. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Oligomeriserung eines VEGFR‐2 spezifischen Bindepeptids über den mitochondrialen Tim10/Tim9‐Komplex eine höhere Affinität gegenüber dem Rezeptor erreicht werden kann. Zudem war es durch die Kombination ErbB2‐ und VEGFR‐2‐bindender Tim10/Tim9‐Komplexe möglich eine bispezifische Variante herzustellen. Bei der Inhibition beider Signaltransduktionswege konnte in verschiedenen Arbeiten ein synergistischer Effekt in Bezug auf die Supression von Tumorwachstum erzielt werden. Als Vertreter der Proteinfamilie konnten hinsichtlich ihrer Faltung komplexe Cystin‐Knoten‐Mikroproteine oligomerisiert werden. Die verwendete Variante ET‐TP‐020 stimulierte in oligomeriserter Form die Proliferation von M‐07e Zellen (humane Megakaryoblasten). Die Stimulation der Zellproliferation setzt eine Darreichung des Bindeproteins in oligomerer Form voraus. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die in dieser Arbeit generierten Komplexe auch im zellulären Kontext eine oligomerisierungsabhängige Aktivität aufweisen. Im letzten Abschnitt wurde die Möglichkeit der spezifischen chemischen Funktionalisierung untersucht. Dabei konnte ein Verfahren aufgebaut werden, das durch Oxidation des durch Spaltung mit TEV‐Protease erhaltenen N‐terminalen Serins zu einer Aldehydfunktion eine spezifische Kopplung von Hydrazid‐ oder Thiosemicarbazidderivaten ermöglicht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Kopplung eines Fluorescein‐5‐Thiosemicarbazids spezifisch an die Tim10‐Untereinheit erfolgt und die Integrität des Tim10/Tim9‐Komplexes erhalten bleibt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass eine rekombinante Oligomeriserung pharmazeutisch relevanter Peptide und Proteine über den mitochondrialen Tim10/Tim9‐Komplex möglich ist und die Oligomeriserung zu einer besseren Affinität konjugierter Peptide führen kann. Das hier vorgestellte System ermöglicht zudem eine gerichtete chemische Funktionalisierung bereits rekombinant funktionalisierter mitochondrialer Tim10/Tim9‐Komplexe.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The aim of this study was the establishment of a recombinant process of peptide and protein oligomerization via the mitochondrial Tim10/Tim9-complex. This system was examined with regard to the generation of bispecific oligomers, oligomerization of proteins, binding to and modulation of pharmaceutically relevant receptors and site-specific chemical functionalization. In the first section of this study an expression system was established that allows both a dual and a bicistronic expression of a functionalized Tim10/Tim9-complex. The experimental results suggest that neither a N- nor a C-terminal fusion of a passenger domain to the Tim10 or Tim9 subunit has an impact on the hexameric structure of the complex. The second section deals with the generation of biofunctional Tim10/Tim9-complexes. It was possible to oligomerize pseudo-cyclic binding peptides, as well as cysteine-knot miniproteins by fusion to the Tim10/Tim9-complex. The oligomerization of a VEGFR-2 specific binding peptide using the mitochondrial Tim10/Tim9-complex leads to a higher affinity for the receptor then the monomeric peptide. By combination of an ErbB2- and a VEGFR-2-binding Tim10/Tim9-complex it was also possible to generate a bi-specific variant. As a representative of the knottin protein family a (in terms of its folding) complex cystine-knot miniprotein was oligomerized by fusion to the mitochondrial Tim10/Tim9-complex. The miniprotein variant used (ET-TP-020) stimulates proliferation of M-07e cells (human megakaryoblastic leukemia cell line) in an oligomeric form. The results indicate that the complexes generated in this work have also an oligomer-dependent activity in a cellular context. In the last section the site-specific chemical functionalization was applied to the Tim10/9 complex. A process could be established to chemically couple a hydrazide or thiosemicarbazide derivative to the N-terminus of the Tim10 subunit. It was shown that upon oxidation of a N-terminal serine to a reactive aldehyde the coupling of a fluorescein-5-thiosemicarbazide specific to the Tim10 subunit is possible and that the established processes maintain the integrity of the hexameric Tim10/Tim9-complex. The present work shows that a recombinant oligomerization of pharmaceutically relevant peptides and proteins using the mitochondrial Tim10/Tim9-Komplex is possible and can lead to an increased net affinity of conjugated peptides. Furthermore, a directed chemical modification of recombinantly functionalized mitochondrial Tim10/Tim9-complexes could be achieved.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Fachbereich Chemie
Date Deposited: 09 Dec 2010 09:46
Last Modified: 07 Dec 2012 11:58
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-23577
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Engstler, Prof. Dr. Markus
Refereed: 12 November 2010
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2357
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