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Development and Characterization of a FKBP51FK1 Affinity Matrix for Protein-Protein Interaction Studies

Merz, Stephanie Katharina (2022)
Development and Characterization of a FKBP51FK1 Affinity Matrix for Protein-Protein Interaction Studies.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00022958
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Development and Characterization of a FKBP51FK1 Affinity Matrix for Protein-Protein Interaction Studies
Language: English
Referees: Hausch, Prof. Dr. Felix ; Löwer, Prof. Dr. Alexander
Date: 2022
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 241 Seiten
Date of oral examination: 11 April 2022
DOI: 10.26083/tuprints-00022958
Abstract:

The FK506 binding protein 51 (FKBP51) plays a role in psychiatric diseases such as major depression and anxiety. Several studies indicated that FKBP51 is also related to cancer, chronic pain and metabolic disorders such as obesity and diabetes. However, the underlying cellular and molecular biological mechanisms are poorly understood. FKBP51 belongs to the FKBP protein family that includes several FK506 binding proteins sharing structural identities. In the last years, FKBP51 has emerged as a drug target, even though the structural similarity of FKBPs makes the development of selective FKBP ligands still challenging. Two FKBP lead compounds, SAFit1 and SAFit2, showing selectivity for FKBP51 in comparison with the biological counterpart FKBP52, were developed by the Hausch research group some years ago. Both compounds interact with the binding pocket of the FK1 domain. Unfortunately, the biological function of FKBP51 and the cellular effects of FKBP ligands are hardly understood until now. The aim of the PhD project was to gain insights into the FKBP51 protein interaction network. The identification of FKBP51 binding partners is a good starting point for elucidating cellular functions, the underlying signal transduction and signaling pathways of FKBP51. The project was focused on the enrichment of potential FKBP51 binding proteins interacting with the binding pocket of the FK1 domain. For this purpose, a FKBP51FK1 affinity matrix was developed and the affinity matrix preparation protocol was optimized. A fluorescence-based binding assay was developed to characterize the FKBP51FK1 affinity matrix. The binding pocket integrity was shown by the binding and competitive elution of a fluorescein-labeled FKBP ligand. A pull-down assay applying FKBP51FK1 as bait was developed to enrich potential FKBP51 binding proteins from cell lysates. The protein enrichment was assessed by a bottom-up proteomic approach in cooperation with SINTEF Industry in Trondheim. Another part of the PhD thesis dealt with the characterization of new FKBP ligands by competitive fluorescence polarization assays. Here, high affinity ligands showing dissociation constants in the picomolar range were discovered. In addition to that, a macrocyclic compound showing selectivity for FKBP51 in comparison with FKBP12 was identified.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Das FK506 bindende Protein FKBP51 spielt eine Rolle bei psychischen Erkrankungen wie zum Beispiel Depression und Angststörung. Zudem wird FKBP51 auch bei metabolischen Erkrankungen wie Fettleibigkeit und Diabetes sowie im Kontext von Krebserkrankungen und chronischem Schmerz beschrieben. Jedoch sind die zugrunde liegenden zellulären Funktionen und biologischen Mechanismen kaum bekannt. Die FKBP-Familie umfasst eine Vielzahl von Mitgliedern mit großen strukturellen Ähnlichkeiten, wodurch die Entwicklung von maßgeschneiderten Liganden zu einer Herausforderung wird. Dennoch ist FKBP51 ein interessantes Zielprotein für die Wirkstoffforschung. Zwei Leitstrukturen, SAFit1 und SAFit2, die eine hohe Selektivität für FKBP51 im Vergleich zu dem biologischen Gegenspieler FKBP52 aufweisen, wurden von der Arbeitsgruppe von Herrn Professor Felix Hausch entwickelt. Beide Substanzen interagieren mit der Bindungstasche innerhalb der FK1 Domäne von FKBP51. Die Charakterisierung des FKBP51 Proteininteraktionsnetzwerks ist ein Ansatz zur Untersuchung der biologischen Funktionen von FKBP51. Zudem können anhand von Proteininteraktionspartnern Rückschlüsse auf die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen und Signaltransduktionswege gezogen werden. Während der Doktorarbeit wurde eine FKBP51FK1 Affinitätsmatrix zur Anreicherung von möglichen Proteinbindungspartnern, die mit der FK1 Domäne interagieren, entwickelt. Dabei wurde das Herstellungsverfahren für die Affinitätsmatrix optimiert. Zur Charakterisierung der FKBP51FK1 Affinitätsmatrix wurde ein fluoreszenzbasierter Bindungsassay entwickelt. Hierbei wurde die Integrität der Bindungstasche durch die Bindung und kompetitive Elution eines mit Fluorescein markierten FKBP Liganden gezeigt. Zur Anreicherung von potentiellen FKBP51 Interaktionspartnern aus Zelllysaten, die mit der Bindungstasche der FK1 Domäne wechselwirken, wurden Pull-Down Assays mit FKBP51 als „Köder“ entwickelt. Die Proteinanreicherung wurde mittels „Peptidmassenfingerprinting“ in Kooperation mit SINTEF Industry in Trondheim untersucht. Zudem wurden neu entwickelte FKBP Liganden mittels Fluoreszenzpolarisationsassay charakterisiert. Hierbei wurden hoch affine FKBP Liganden mit Dissoziationskonstanten im pikomolaren Bereich identifiziert. Weiterhin wurde eine makrozyklische chemische Substanz mit Selektivität für FKBP51 im Vergleich zu FKBP12 identifiziert.

German
Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-229587
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 500 Science
500 Science and mathematics > 540 Chemistry
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
07 Department of Chemistry > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 21 Dec 2022 13:19
Last Modified: 23 Dec 2022 10:11
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/22958
PPN: 503190225
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