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Investigating the importance of RAD54 and NEK1 in homologous recombination within the developing mouse

Thomas, Holly (2022)
Investigating the importance of RAD54 and NEK1 in homologous recombination within the developing mouse.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00022952
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Investigating the importance of RAD54 and NEK1 in homologous recombination within the developing mouse
Language: English
Referees: Löbrich, Prof. Dr. Markus ; Laube, Prof. Dr. Bodo ; Rödel, Prof. Dr. Franz ; Cardoso, Prof. Dr. Cristina
Date: 2022
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 127 Seiten
Date of oral examination: 11 November 2022
DOI: 10.26083/tuprints-00022952
Abstract:

Mammalian development begins in the zygote whereby regulated mass cell expansion takes place to create a living organism. However, efficient cell expansion relies on multiple mechanisms including, the maintenance of genomic integrity. DNA damage can originate from endogenous and exogenous sources and cells rely on the use of specific repair pathways to repair a genotoxic insult. Types of damage include single-strand breaks, double-strand breaks (DSBs), base mismatches and bulky adducts. Of these DSBs represent one of the most dangerous types of lesions a cell can encounter. If a DSB is left unrepaired or is mis-repaired, then genomic stability and cell viability are at risk. Two primary mechanisms are available to repair DSBs in eukaryotic cells and the choice of pathway is dependent on various factors including the cell cycle phase. The first is, non-homologous end joining (NHEJ) which operates throughout the cell cycle and in G0. The second, homologous recombination (HR), provides a high-fidelity mechanism of error-free repair and is only available during S and G2 phases, due to the need for a second homologous sequence, typically the sister chromatid, for DNA synthesis. During later steps of HR, after a process called resection, two strands of single-stranded DNA (one on either break site) are coated with a protein called RAD51. This enables a homology search to find the homologous sequence of DNA on the sister chromatid. RAD51 is removed by the repair protein RAD54 so DNA synthesis can proceed, leading to the completion of repair. Over the past 30 years, an expansion of studies has been published concerning the mechanisms surrounding HR. One important publication defines the regulation of RAD54, in an in vitro human model system. Spies et al. (2016) describe how the kinase NEK1 phosphorylates RAD54 specifically in G2 phase which activates RAD54 to remove RAD51 from ssDNA. Via the use of phospho-mimic and phospho-mutant RAD54 cell systems, Spies et al. found that the premature phosphorylation of RAD54 in S phase results in early removal of RAD51 from the ssDNA, resulting in fork degradation and a repair defect, therefore highlighting the importance in the timing of the regulation. But, is NEK1 responsible for regulating RAD54 in vivo? This study investigates the role of NEK1 in vivo, using knockout mouse strains of Nek1 and Rad54. As HR is extremely important and vastly utilised during early development, experiments were conducted in embryonic, neonatal and juvenile mice. A novel in vivo immunofluorescence (IF) staining assay identifies HR repair alongside cell cycle progression and assesses DSBs undergoing HR after ionising radiation (IR). Specifically, organs of the central nervous system (CNS) and the small intestine were used. A comparison of the DNA damage response therefore can be ascertained between tissues and developmental stages following IR. Loss of RAD54 leads to an HR repair defect after IR in all mouse tissues analysed. However, the scale of the defect varies in a tissue-dependent manner. Quantitative analysis in the unirradiated Rad54-/- mice showed a potential role of RAD54 in replication but in a tissue and developmental-specific manner. Interestingly the role of NEK1 differs during development with an HR repair defect only being present in the juvenile developmental stage. IF imaging confirms this change in the role of NEK1 throughout development with NEK1 localising in the cytoplasm during early development but then localises to the nucleus by the juvenile developmental stage. Nek1-/- mice also develop a later onset phenotype including growth retardation which is only apparent between the neonatal and juvenile stages. Taken together, these results would indicate a differential role for NEK1 during development.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Die Entwicklung von Säugetieren beginnt in der Zygote. Hier findet eine regulierte Massenvermehrung von Zellen statt, um einen lebenden Organismus zu erschaffen. Eine effiziente Zellexpansion hängt jedoch von mehreren Mechanismen ab, zu denen auch die Erhaltung der genomischen Integrität gehört. DNA-Schäden können aus endogenen und exogenen Quellen stammen und die Zellen sind auf die Nutzung spezifischer Reparaturwege angewiesen, um einen genotoxischen Schaden zu beheben. Einzelstrangbrüche, Doppelstrangbrüche (DSB), Basenfehlanpassungen und sperrige Addukte sind verschiedene DNA-Schäden die auftreten können. DSBs stellen eine der gefährlichsten Läsionen dar, denen eine Zelle begegnen kann. Wenn ein DSB nicht oder falsch repariert wird, sind die genomische Stabilität und die Lebensfähigkeit der Zelle gefährdet. Für die Reparatur von DSBs in eukaryontischen Zellen stehen zwei primäre Mechanismen zur Verfügung, wobei die Wahl des Weges von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Zellzyklusphase, abhängt. Der erste ist das Nicht-homologe endjoining (NHEJ), das während des gesamten Zellzyklus und in G0 zur Verfügung steht. Der zweite Weg, die homologe Rekombination (HR), bietet einen Mechanismus zur fehlerfreien Reparatur mit hoher Zuverlässigkeit, steht abernur in den Phasen S und G2 zur Verfügung, da für die DNA-Synthese eine zweite homologe Sequenz, in der Regel das Schwesterchromatid, erforderlich ist. In den späteren Schritten der HR werden nach einem Prozess, der als Resektion bezeichnet wird, zwei einzelsträngige DNA-Stränge (ssDNA) mit einem Protein namens RAD51 beschichtet. Dies ermöglicht eine Homologiesuche, um die homologe DNA-Sequenz auf dem Schwesterchromatid zu finden. RAD51 wird durch das Reparaturprotein RAD54 entfernt, so dass die DNA-Synthese fortgesetzt werden kann, was zum Abschluss der Reparatur führt. In den letzten 30 Jahren wurden eine Vielzahl von Studien zu den Mechanismen der HR veröffentlicht. Eine wichtige Veröffentlichung definiert die Regulierung von RAD54 in einem menschlichen in-vitro Modellsystem. Spies et al. (2016) beschreiben, wie die Kinase NEK1 RAD54 spezifisch in der G2-Phase phosphoryliert, wodurch RAD54 aktiviert wird, um RAD51 von ssDNA zu entfernen. Durch die Verwendung von phospho-mimischen und phospho-mutanten RAD54-Zellsystemen fanden Spies et al. heraus, dass die vorzeitige Phosphorylierung von RAD54 in der S-Phase zu einer frühen Entfernung von RAD51 von der ssDNA führt, was eine Degradierung der Replikationsgabel und einen Reparaturdefekt zur Folge hat und somit die Bedeutung des Zeitpunkts der Regulierung hervorhebt. Aber ist NEK1 auch für die Regulierung von RAD54 in vivo verantwortlich? In dieser Studie wird die Rolle von NEK1 in vivo untersucht, wobei Knockout-Mausstämme von Nek1 und Rad54 verwendet werden. Da die HR sehr wichtig ist und während der frühen Embryonalentwicklung stark genutzt wird, wurden die Experimente an embryonalen, neonatalen und juvenilen Mäusen durchgeführt. Durch eine neuartige in-vivo Immunfluoreszenzfärbung (IF) konnte die HR-Reparatur parallel zur Zellzyklusprogression visualisiert werden und DSBs, die nach ionisierender Strahlung (IR) eine HR durchlaufen, quantifiziert werden. Im Anschluss wurden Organe des zentralen Nervensystems (ZNS) und des Dünndarms ausgewertet. Somit konnte die DNA-Reparatur in verschiedenen Geweben und Entwicklungsstadien nach IR untersucht werden. Der Verlust von RAD54 führt zu einem HR-Reparaturdefekt nach IR in allen untersuchten Mausgeweben. Das Ausmaß des Defekts variiert jedoch gewebeabhängig. Die quantitative Analyse der unbestrahlten Rad54-/- Mäuse zeigte eine mögliche Rolle von RAD54 bei der Replikation, die Gewebs- und Entwicklungsspezifisch zu sein scheint. Interessanterweise ändert sich die Rolle von NEK1 während der Entwicklung, wobei ein HR-Reparaturdefekt nur im jugendlichen Entwicklungsstadium auftritt. Die Visualisierung der IF Färbungen bestätigte diese Veränderung der Rolle von NEK1 im Laufe der Entwicklung, wobei NEK1 in den früheren Stadien im Zytoplasma lokalisiert ist, während es im juvenilen Entwicklungsstadium in den Zellkern wandert. Nek1-/- Mäuse entwickeln auch einen später einsetzenden Phänotyp, einschließlich einer Wachstumsverzögerung, die nur zwischen dem neonatalen und dem juvenilen Stadium zu beobachten ist. Zusamengefasst deuten diese Ergebnisse auf eine differenzierte Rolle von NEK1 während der Entwicklung hin.

German
Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-229520
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
Divisions: 10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 06 Dec 2022 14:34
Last Modified: 07 Dec 2022 06:57
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/22952
PPN: 502330333
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