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Reconstitution and functional characterisation of simple channel proteins in the planar lipid bilayer

Henkel, Michael :
Reconstitution and functional characterisation of simple channel proteins in the planar lipid bilayer.
TU Darmstadt / Botanik / Biologie
[Ph.D. Thesis], (2010)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Reconstitution and functional characterisation of simple channel proteins in the planar lipid bilayer
Language: English
Abstract:

The present study describes the electrophysiological characterisation of different primitive channel-forming proteins, respectively peptides. Using the so-called `planar lipid bilayer technique`, which is a maximally reduced system for the functional reconstitution and electrophysiological characterization of purified channel proteins, protein-/ peptide-mediated single channel currents were measured. Depending on defined ion concentrations in the bath solution on cis- and trans-side of a membrane, typical properties of the reconstituted channels such as current/ voltage relationships, open probability and selectivities could be determined. Chapter 2 deals with the wildtype and two different mutants of Kcv, a tetrameric K+ channel, which is encoded by the Paramecium bursaria Chlorella Virus-1 (PBCV-1). The data reveal that the subtle mutation of one amino acid (T->S of residue 63), which lies in the selectivity filter next to the cavity, almost completely reverses the ability of the wildtype to be blocked by Ba2+. Furthermore, the mutation causes a considerable increased open probability, whereas the channel rarely reaches the maximal conductance level; mostly the channel opens to different subconductances. These subconductances probably reflect different kinetic states of the channel; simulations based on Markov models reveal that a very fast gating in combination with a limited registration of the channel gating can be responsible for apparent subconductances. The altered function of the mutant must be due a sensitive change in the protein structure because a mutation of a second, adjacent amino acid is able to recover the properties of the wildtype. Chapter 3 deals with different versions of the PB1-F2 protein which are encoded by different Influenza A viruses. It was already described in literature that this protein is able to augment the conductance in the planar lipid bilayer. The absence of discrete conductance fluctuations suggested that PB1-F2 is not a canonical channel. However, the instant study shows that synthetic peptide analogues of PB1-F2 generate canonical channel function in the planar lipid bilayer. In combination with fluorometric studies, the electrical data reveal that the PB1-F2-generated channels possess two discrete conductance levels and unspecifically conduct cations and anions. Chapter 4 deals with phospholamban, a protein whose function as modulator of the sarco-/ endoplasmatic Ca-ATPase (SERCA) was described already previously. For a long time it was known that the monomer of phospholamban is in equilibrium with the pentameric form, whereas the latter one is considerably more stable. It is a matter of discussion whether the pentamer has a channel function. Impedance measurements in so-called `supported nano-BLMs`, in which the protein was reconstituted and which were performed in cooperation with the group of Moncelli at the institute for chemistry of the University of Florence, show that phospholamban indeed induces typical ion channel fluctuations in membranes. The reconstitution of phospholamban in the planar lipid bilayer supports the hypothesis of a phospholamban-mediated channel function with two discrete cation-selective conductance levels at 16 pS and 27 pS.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die vorliegende Arbeit behandelt die elektrophysiologische Charakterisierung verschiedener primitiver kanalbildener Proteine bzw. Peptide. Mithilfe der sogenannten `planaren Lipid Bilayer Technik`, welches ein maximal artifizielles System zur funktionellen Rekonstitution und zur Untersuchung von gereinigten Kanalproteinen darstellt, wurden protein-/ peptidvermittelte Einzelkanalströme gemessen. In Abhängigkeit von definierten Ionenkonzentrationen in den Badlösungen auf der cis- und trans-Seite einer Membran ließen sich die für die Proteine typischen Eigenschaften wie Strom/ Spannungs-Beziehungen, Offenwahrscheinlichkeiten, sowie Selektivitäten ermitteln. Kapitel 2 behandelt den Wildtyp, sowie zwei unterschiedliche Mutanten von Kcv, einem tetrameren Kaliumkanal, welcher von dem Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 (PBCV-1) kodiert wird. Die Daten zeigen, dass die subtile Mutation (T->S am Rest 63), einer zur Kavität des Kanals angrenzenden Aminosäure im Selektivitätsfilter, die Blockierbarkeit des Wildtyps durch Barium nahezu gänzlich aufzuheben vermag. Darüber hinaus verursacht die Mutation eine deutlich erhöhte Offenwahrscheinlichkeit des Kanals, wobei der Kanal jedoch nur selten die volle Leitfähigkeit erlangt; meist öffnet der Kanal nur zu verschiedenen Unterleitwerten. Wahrscheinlich reflektieren diese Unterleitwerte unterschiedliche kinetische Zustände des Kanals; Simulationen auf Grundlage von Markov-Modellen zeigen, dass ein sehr schnelles Gating, in Kombination mit einer limitierten Registrierung des Kanalschaltens, für apparente Unterleitwerte verantwortlich sein kann. Die Funktionsveränderungen müssen auf einer empfindlichen Änderung in der Struktur des Proteins beruhen, denn ein Austausch zweier benachbarter Aminosäuren an derselben Stelle (T->S am Rest 63 und S->T am Rest 62) führt dazu, dass der Kanal wieder wie der Wildtyp schaltet. Kapitel 3 behandelt unterschiedliche synthetische Varianten des PB1-F2-Proteins, welches in vivo von verschiedenen Influenza-A-Viren kodiert wird. In der Literatur wurde bereits beschrieben, dass das Protein in der Lage ist, im planaren Lipid-Bilayer eine Leitfähigkeit zu vermitteln. Das Auftreten von diskreten Leitfähigkeiten jedoch, verbunden mit Schaltereignissen, die für eine Funktion als Einzelkanal sprechen, war für dieses Protein zuvor noch nicht beschrieben worden. In dieser Arbeit konnte der Nachweis für eine kanonische Kanalfunktion des Proteins erbracht werden. In Kombination mit fluorimetrischen Studien zeigen die elektrischen Daten, dass der PB1-F2-generierte Kanal zwei diskrete Leitfähigkeiten hat und unspezifisch Kationen und Anionen leitet. Kapitel 4 befasst sich mit Phospholamban, einem Protein, dessen Funktion als Modulator der sarco-/ endoplasmatischen Ca-ATPase (SERCA) bereits früher beschrieben wurde. Bekannt war seit langem, dass Phospholamban in zwei gleich häufig verteilten strukturellen Konformationen vorliegt, nämlich als Monomer und als Pentamer, wobei letztere die deutlich stabilere von beiden darstellt. Sehr umstritten ist die Hypothese, dass das Pentamer eine Kanalfunktion besitzt. Impedanzmessungen an so genannten `supported nano-BLMs`, in denen das Phospholamban-Protein rekonstituiert ist, und die in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Moncelli am Institut für Chemie der Universität Florenz durchgeführt wurden, zeigen, dass Phospholamban in der Tat eine Ionenleitfähigkeit in Membranen induziert. Die Rekonstitution von Phospholamban im planaren Lipid- Bilayer unterstützt die These einer durch Phospholamban vermittelten Kanalfunktion. Im Bilayer können durch Phospholamban induziert zwei diskrete kationenselektive Leitwerte von 16 pS und 27 pS registriert werden.German
Uncontrolled Keywords: single ion channel reconstitution, planar lipid bilayer, electrophysiology, PB1-F2, Kcv, Phospholamban
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
single ion channel reconstitution, planar lipid bilayer, electrophysiology, PB1-F2, Kcv, PhospholambanEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 18 Sep 2010 10:28
Last Modified: 07 Dec 2012 11:58
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-22841
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Galuske, Prof. Dr. Ralf
Refereed: 3 September 2010
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2284
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