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Distribution and dynamics of charged particle-induced DNA double-strand breaks

Splinter, Jörn :
Distribution and dynamics of charged particle-induced DNA double-strand breaks.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2010)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Distribution and dynamics of charged particle-induced DNA double-strand breaks
Language: English
Abstract:

The efficient repair of DNA double-strand breaks (DSBs) is clearly decisive in determining the ‘fate’ of damaged cells, but the spatiotemporal organisation of repair events that might explain the formation of chromosomal misrejoining and genome instability is not yet clear. Following generation of DSBs the histone variant H2AX is phosphorylated (gH2AX) comprising megabase-pair regions of the chromatin around the DSB (Rogakou et al. 1998; Rogakou et al. 1999) that can be visualized by immunostaining. Irradiation of cell nuclei with charged particles leads to the spatially defined production of DSBs along the particle trajectory, thus facilitating studies on the dynamics of ionizing radiation-induced foci (IRIF) associated with lesion processing. Microscopic imaging of ion-induced IRIF patterns in fixed and living cells revealed that lesion density has only a minor impact on the pattern and number of gH2AX IRIF (Chapter Four) and showed a general positional stability of DNA lesions (Chapter Five), respectively. The former finding demonstrates that the number of visualized IRIF following ion irradiation is below the amount expected for the applied doses and it was suggested that single IRIF might contain several damage sites corresponding to the high lesion density induced by ions (Jakob et al. 2003; Costes et al. 2007). We addressed this question using repair-related proteins forming smaller (micro-)foci compared to gH2AX, but despite some gH2AX IRIF containing multiple micro-foci its number was still lower than expected. Therefore, high-resolution 4Pi microscopy was applied (AG Hell, DKFZ Heidelberg) to resolve a potential substructure of micro-foci. However, a substructure was only observed for gH2AX and 53BP1 signals, but not for the micro-foci forming repair-proteins RPA and hMre11 (Chapter Six). Nevertheless, despite the restricted dynamic range of foci numbers following ion irradiation of different LETs the application of micro-foci marker allowed a rough estimation of the dose deposited by UVA laser microirradiation. For this laser-induced RPA IRIF patterns were compared with patterns induced by low angle ion irradiation (Jakob et al. 2003) of different LETs (Chapter Six). The laser dose was estimated to be in the range of hundreds of Gray. As a further aspect of IRIF patterns an influence of chromatin structure on the foci positions was recently discussed by Costes et al. (2007) reporting a preferential localization of gH2AX signals at the interface between regions of low and high intensive DNA staining. In agreement with the here described slow and confined damage motion (Chapter Five), these authors hypothesized that a potential small range damage translocation might occur. To elucidate such a dynamic process we used low angle and targeted single ion irradiation to induce DSBs spatially confined inside heterochromatic compartments in mammalian cells and analyzed the 3D geometry of induced gH2AX and XRCC1 signals at different time point post-irradiation (Chapter Seven). We demonstrate that, contrary to the current notion, phosphorylation of H2AX is indeed possible within heterochromatin and that damage sites induced in the interior of heterochromatic compartments are expelled to the periphery within 20 min. We further show that this relocation is independent of ATM, a protein previously reported to be involved in the repair of heterochromatin-associated damages (Goodarzi et al. 2008). Taken together, the here described results suggest that chromatin structure and not an repair-related directional mobility of damage sites is responsible for the preferentially localization of IRIF at the border of intensively stained chromatin regions and for the characteristic gap structure of ion-induced IRIF patterns.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die effiziente Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) ist entscheidend für das Schicksal beschädigter Zellen. Trotzdem ist die räumliche und zeitliche Organisation der Reparaturabläufe, die das Entstehen chromosomaler Fehlverknüpfungen und genomischer Instabilität erklären könnten, bisher nicht verstanden. Nach der Generierung von DSBs wird die Histonvariante H2AX in einem Megabasenpaar-Bereich um den Bruch zu gH2AX phosphoryliert (Rogakou et al. 1998; Rogakou et al. 1999), das durch immunozytochemische Färbung sichtbar gemacht werden kann. Die Bestrahlung von Zellkernen mit geladenen Teilchen führt entlang der Teilchenbahn zu einer räumlich begrenzten Induktion von DSBs. Dies ermöglicht Untersuchungen zur Dynamik von DNA Schäden, die indirekt über gH2AX oder andere akkumulierende Reparatur-relevante Proteine beobachtet werden. Mikroskopaufnahmen dieser Akkumulationen (Foci) zeigen nach Ionen Bestrahlung charakteristische Muster in fixierten und lebenden Zellen. Wir zeigen hier, dass die Schadensdichte nur einen geringen Einfluss auf die Verteilung und Anzahl der gH2AX Foci hat (Kapitel Vier) und die Position einer Schadensstelle generell stabil ist (Kapitel Fünf). Ersteres demonstriert, dass die Anzahl beobachteter Foci nach Ionenbestrahlung unterhalb der Menge liegt, die bei entsprechend applizierter Dosis angenommen werden kann. Es wurde vorgeschlagen, dass entsprechend der hohen Schadensdichte entlang der Ionentrajektorie, einzelne Foci möglicherweise mehrere Schadensstellen enthalten (Jakob et al. 2003; Costes et al. 2007). Wir gingen dieser Frage nach, indem wir Reparaturproteine beobachteten, die im Vergleich zu gH2AX kleinere (Mikro)foci bilden. Obwohl sich in manchen gH2AX Foci mehrere Mikrofoci fanden, blieb auch die Mirkofocizahl hinter den Erwartungen zurück. Deswegen verwendeten wir hoch-auflösende 4Pi Mikroskopie (AG Hell, DKFZ Heidelberg), um eine potentielle Substruktur der Mikrofoci aufzulösen. Solch eine Substruktur konnte in gH2AX und 53BP1 Signalen beobachtet werden, nicht jedoch in den Signalen der Mikrofoci-bildenden Reparaturproteine RPA und hMre11 (Kapitel Sechs). Obwohl die Anzahl Ionen-induzierter Foci nur schwach von den jeweiligen LETs der Ionen abhängt, erlaubte die Verwendung von Mirkofoci-Markern eine grobe Abschätzung der deponierten Dosis bei UVA Laser Mikrobestrahlungen. Dafür wurden RPA Foci Muster verglichen, die entweder durch Laserbestrahlung oder Schmalwinkel-Bestrahlung mit Ionen unterschiedlicher LETs (Jakob et al. 2003) induziert wurden (Kapitel Sechs). Die abgeschätzte Laser-Dosis liegt im Bereich mehrerer hundert Gray. Kürzlich wurde von Costes et al. (2007) ein Einfluss der Chromatinstruktur auf die Focipositionierung diskutiert. Dieser berichtete von einer bevorzugten Lokalisierung von gH2AX Signalen am Übergang zwischen DNA Färbungen niedriger und hoher Intensität. Die Autoren nehmen an, dass in Übereinstimmung mit der hier beschriebenen langsamen und begrenzten Schadensbewegung (Kapitel Fünf), eine kurzreichweitige Schadenstranslokation stattfindet. Um einen solchen dynamischen Prozess zu verfolgen, benutzten wir Schmalwinkel- und Einzel-Ionen- Bestrahlung, die DSBs räumlich begrenzt innerhalb heterochromatischer Kompartimente induzieren. Wir analysierten die Geometrie induzierter H2AX und XRCC1 Signale zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Bestrahlung von Säugerzellen (Kapitel Sieben). Die Ergebnisse zeigen, dass entgegen der weitläufigen Meinung, die Phosphorylierung von H2AX auch in Heterochromatin möglich ist, und dass Schadensstellen, die im Innern heterochromatischer Regionen generiert werden innerhalb von 20 min ausgestülpt werden. Dieser Prozess ist unabhängig von ATM, einem Protein, das in der Reparatur Heterochromatin-assoziierter DNA Schäden involviert ist (Goodarzi et al. 2008). Zusammengefasst deuten die hier beschriebenen Resultate darauf hin, dass die bevorzugte Lokalisierung der Foci am Rande stark gefärbter Chromatinregionen und die Lücken in Ioneninduzierten Focimustern nicht auf eine Reparatur-bezogene gerichtete Bewegung von Schadensstellen sondern auf die Struktur des Chromatins zurückzuführen sind.German
Uncontrolled Keywords: DNA repair, DNA damage, heterochromatin
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
DNA repair, DNA damage, heterochromatinEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology > Zoology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 27 Jul 2010 09:40
Last Modified: 07 Dec 2012 11:58
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-22287
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Durante, Prof. Dr. Marco and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 11 May 2010
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2228
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