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STRUKTUR-FUNKTIONS-BEZIEHUNG VIRALER KALIUMKANÄLE Einfluss der Transmembrandomänen auf die Funktion und Sortierung von Kaliumkanälen

Baumeister, Dirk :
STRUKTUR-FUNKTIONS-BEZIEHUNG VIRALER KALIUMKANÄLE Einfluss der Transmembrandomänen auf die Funktion und Sortierung von Kaliumkanälen.
TU Darmstadt /Fachbereich 10 / Institut für Botanik / AG Thiel
[Ph.D. Thesis], (2010)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: STRUKTUR-FUNKTIONS-BEZIEHUNG VIRALER KALIUMKANÄLE Einfluss der Transmembrandomänen auf die Funktion und Sortierung von Kaliumkanälen
Language: German
Abstract:

Die Funktion von Ionenkanälen ist für zahlreiche zelluläre Prozesse essentiell und spielt sowohl in der biologischen, als auch in der medizinischen Forschung eine immer wichtigere Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Struktur/Funktions-Beziehungen der zwei minimalen viralen Kaliumkanäle Kcv und Kesv untersucht. Im besonderen Fokus stand auf der einen Seite die Aufklärung des molekularen Gating-Mechanismus des Kcv-Kanals und auf der anderen Seite die Untersuchung des veränderten targetings des Kesv-Kanals. Die elektrophysiologische Charakterisierung von Kcv-Mutanten, deren äußere Transmembrandomäne (TM1) um je ein Alanin verlängert wurde, konnte drei Beiträge zum Verständnis der Struktur/Funktions-Beziehung von Kcv leisten: (i) schnelles und langsames Gating sind zwei voneinander unabhängige Prozesse, (ii) die TM1 von Kcv weist eine funktionelle Gliederung auf und (iii) das langsame Gating basiert auf Salzbrückeninteraktionen zwischen dem C-Terminus der TM2 und dem N-terminalen Proteinabschnitts. Mit Hilfe von temperaturabhängigen Messungen konnten erstmalig experimentelle Daten gewonnen werden, die nahe legen, dass Salzbrückeninteraktionen die molekulare Grundlage für das langsame Gating bilden. Die Energiebarriere, die beim Gating überwunden werden muss, liegt mit 45 ± 2,5 KJ/mol bei -140 mV auf einem Niveau, das dem Aufbrechen von Salzbrücken entspricht. Dies wird zudem durch den Befund bestärkt, dass die entsprechenden Mutationen im Bereich von möglichen Salzbrücken zwischen den Transmembrandomänen liegen. Ein Gating-Modell von Kcv über Salzbrücken basiert demzufolge darauf, dass der Kanal bei geschlossener Salzbrücke offen ist. Sobald die Salzbrücke aufbricht, werden Kaliumionen durch die nun freie Carboxylgruppe des C-Terminus abgefangen, so dass es zu einem „Kaliumblock“ für den Austritt von Kaliumionen aus der Cavität des Kaliumkanals kommt. Dem Modell zufolge wird der Kanal spannungsabhängig geöffnet indem sich bei negativer Spannung mehr Salzbrücken bilden, die somit mehr Kanäle öffnen. Dies resultiert in einer langsamen Aktivierung des Stroms, wie es bei den Insertionsmutanten von Kcv beobachtet wurde. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Signale für eine intrazelluläre Sortierung des zweiten viralen Kaliumkanals Kesv untersucht. Dazu wurde die Methode der randomized site directed PCR entwickelt. Diese Technik ist in Kombination mit der Hefekomplementation als Selektionsverfahren geeignet, um mittels Directed Evolution definierte Proteinabschnitte zu randomisieren, um so unvoreingenommen nach funktionellen Mutanten zu screenen. Es zeigte sich, dass eine Insertion von 3 Aminosäuren an Position 113 von Kesv nur bei wenigen Konstrukten zu einer Redirektionierung des targetings von den Mitochondrien zur Plasmamembran führt. Die Analyse der positiven Mutanten ergab, dass der Sequenzbereich, der das targeting bestimmt weitgehend sequenzunspezifisch ist; das veränderte targeting basiert vor allem auf einer strukturellen Verlängerung der äußeren Transmembrandomäne. Insgesamt unterstreichen die Ergebnisse, dass die neu entwickelte Randomisierungsmethode gut geeignet ist um unvoreingenommene, willkürliche Mutationen in definierte Proteinabschnitte einzufügen und deren Struktur/Funktions-Zusammenhänge zu untersuchen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The correct functioning of ion channels plays an important role in numerous cellular processes; hence they are the focus of many recent biological and medical studies. The present study is concerned with analysis of structure/function-relationships in the two minimal viral potassium channels Kcv and Kesv. Special focus is on the understanding of the molecular gating-mechanism of Kcv on the one hand and the cellular targeting of Kesv on the other hand. The electrophysiological charactarization of Kcv-mutants, in which the outer transmembrane-domain was extended by one alanine, contributed in three aspects to the understanding of structure/function relationships in Kcv: (i) fast and slow gating are two autonoumus processes, (ii) the first transmembrane domain shows a functional segmentation and (iii) the slow gating-mechanism is based on salt bridge interactions between the C-terminus of the inner transmembrane domain (TM2) and the N-terminus of the protein. Temperature dependent measurements of channel gating imply that interactions of salt bridges are the molecular basis for the slow gating-process. The energy barrier of 45 ± 2,5 KJ/mol at -140 mV for the slow gating-process correlates with the energy, which is needed for breaking salt bridges. Furthermore also the fact that that the mutations, which affect slow gating are located in an area of the protein, in which possible salt bridge interactions take place, underline this mechanism. Accordingly a gating-model for Kcv which is based on salt bridge interactions implies that the channel opens upon closing of the salt bridges. Soon after the salt bridge breaks a free potassium ion can interact with the free carboxylgroup of the C-terminus resulting in a “potassium-block” of the potassium channel. According to this gating model the channel undergoes voltage dependent opening as a consequence of the closing of salt bridges which is favored by higher negative voltages. The second part of the present study focuses on the intracellular sorting of the viral potassium channel Kesv. In order to detect the structural information for targeting a new randomization method has been established. The randomized site directed PCR is a powerful technique for analyzing defined protein segments under the aspect of directed evolution. In combination with the yeast-complementation assay it is an unbiased screening method for functional mutants. With this technique it could be shown, that an insertion of 3 amino acids at position 113 of Kesv leads to functional mutants, which are no longer sorted to the mitochondria but to the plasmamembrane. The analysis of these mutants shows that the different sorting is based on a sequence-unspecific elongation of the second transmembrane domain. These results underline the suitability of the new randomization technique for unbiased mutations of defined proteinsegments for structure/function analysis.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology > Botany > Plant Membrane Biophysics
Date Deposited: 23 Jun 2010 09:54
Last Modified: 07 Dec 2012 11:57
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-21998
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Bertl, Prof. Dr. Adam
Refereed: 4 June 2010
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2199
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