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Analyzing the engineering potential of subtilosin A by probing the substrate promiscuity of the thioether forming sactisynthase AlbA

Ali, Ataurehman (2022)
Analyzing the engineering potential of subtilosin A by probing the substrate promiscuity of the thioether forming sactisynthase AlbA.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00021802
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Analyzing the engineering potential of subtilosin A by probing the substrate promiscuity of the thioether forming sactisynthase AlbA
Language: English
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Stein, Prof. Dr. Viktor ; Neumann, Prof. Dr. Siegfried ; Schmitz, Prof. Dr. Katja
Date: 2022
Place of Publication: Darmstadt
Collation: iii, 121 Seiten
Date of oral examination: 13 June 2022
DOI: 10.26083/tuprints-00021802
Abstract:

Sactipeptides are members of a small but growing class of ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptides (RiPPs) that are characterized by unique cysteine-sulfur-to-α-carbon crosslinks. This thioether pattern between the donor cysteine side chains and the corresponding acceptors, catalyzed by so called sactisynthases, confers increased structural, thermal, and proteolytic stability as well as a rigid structure to sactipeptides. These traits render these unique scaffolds very attractive for the development of novel biotherapeutics. This work aimed to analyze the substrate promiscuity of the sactisynthase AlbA from the subtilosin A gene cluster in detail. In particular, the ability of the sactisynthase to tolerate major sequence substitutions and insertions was investigated towards the formation of so called sactionine bridges, which were identified and verified mass-spectrometrically. To analyze these exotic scaffolds, the designed sactipeptide variants were expressed in E. coli BL23(DE3). The first part of the work assessed the capability of AlbA to modify non-native sactipeptides. For this purpose, two strategies were followed and the sactisynthase successfully modified two unfamiliar sactipeptides, albeit with a decreased efficiency. Moreover, sactipeptide hybrid peptides consisting of the donor and loop regions of subtilosin A and the C-terminal acceptor region of four different Type I sactipeptides were designed and analyzed by mass spectrometry. These results provide novel insights into the regioselective performance of AlbA. In the second part of the present work, the ability of AlbA to tolerate larger amino acid sequences into the loop region of subtilosin A was scrutinized with respect to the introduced thioether bonds. This allowed the identification of a suitable position within the loop region of subtilosin A for the insertion of various foreign sequences without hampering the AlbA mediated post-translational modifications. The number of installed thioethers varied depending on whether the incorporated sequences met one of the two requirements: (i) a relatively short sequence or (ii) a structural pre-assembled sequence. The third part of the work was devoted to the functionalization of the sactipeptide subtilosin A. By successfully introducing biologically active sequences into the identified position in the loop region of the sactipeptide, the intrinsic traits of the generated thioether-constrained subtilosin A variants were next analyzed in more detail. In summary, specific receptor and pocket binding activities as well as a protease inhibitory property were successfully introduced, which however, suffered from low potency. In the present proof-of-concept work, a strategy was established for the functionalization of the sactipeptide subtilosin A. This approach could enable the functionalization of other sactipeptides as well as the generation of tailor-made subtilosin A variants with improved biological properties.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Sactipeptide sind eine kleine, aber wachsende Klasse von ribosomal synthetisierten und posttranslational modifizierten Peptiden (RiPPs), die durch einzigartige Cystein-Schwefel-α-Kohlenstoff-Querverbindungen gekennzeichnet sind. Dieses Thioether-Muster zwischen den Donor-Cystein-Seitenketten und den entsprechenden Akzeptor Aminosäuren, das durch so genannte Sactisynthasen katalysiert wird, verleiht den Sactipeptiden eine erhöhte strukturelle, thermische und proteolytische Stabilität sowie eine starre Struktur. Diese Eigenschaften machen diese einzigartigen biologischen Gerüste sehr attraktiv für die Entwicklung neuer Biotherapeutika. Ziel dieser Arbeit war es, die Substrat-Promiskuität der Sactisynthase AlbA aus dem Subtilosin A Gencluster im Detail zu analysieren. Insbesondere wurde die Fähigkeit der Sactisynthase untersucht, größere Substitutionen und Insertionen in Subtilosin A zu tolerieren. Besonders die Bildung dieser so genannten Sactioninbrücken wurde untersucht. Um diese exotischen Gerüste zu analysieren, wurden die entworfenen Sactipeptidvarianten in E. coli BL23(DE3) exprimiert. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Fähigkeit von AlbA untersucht, nicht-native Sactipeptide zu modifizieren. Zu diesem Zweck wurden zwei Strategien verfolgt und die Sactisynthase modifizierte erfolgreich zwei unbekannte Sactipeptide, wenn auch mit einer geringeren Effizienz. Darüber hinaus wurden Sactipeptid-Hybridpeptide, die aus den Donor- und Loop-Regionen von Subtilosin A und der C-terminalen Akzeptor Region von vier verschiedenen Typ-I-Sactipeptiden bestanden, entworfen und mittels Massenspektrometrie analysiert. Diese Ergebnisse gaben Aufschluss über die regioselektive Aktivität von AlbA. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Fähigkeit von AlbA analysiert, größere Aminosäuresequenzen in der Schleifenregion von Subtilosin A zu tolerieren. Dadurch konnte eine Position in der Schleifenregion von Subtilosin A identifiziert werden, in die verschiedene Sequenzen eingeführt werden konnten, ohne die von AlbA vermittelten posttranslationalen Modifikationen zu behindern. Die Anzahl der eingebauten Thioetherbrücken variierte je nachdem, ob die eingebauten Sequenzen eine der beiden Anforderungen erfüllten: (i) eine relativ kurze Sequenz oder (ii) eine strukturell vormontierte Sequenz. Der dritte Teil der Arbeit war der Funktionalisierung des Sactipeptids Subtilosin A gewidmet. Nach der erfolgreichen Einführung biologisch aktiver Sequenzen in die identifizierte Position in der Schleifenregion des Sactipeptids, wurden die biologischen Eigenschaften der erzeugten Thioether verbrückten Subtilosin A Varianten anschließend genauer analysiert. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass spezifische Rezeptor- und Taschenbindungsaktivitäten sowie eine Protease inhibitorische Eigenschaft erfolgreich eingeführt wurden, die jedoch eine eingeschränkte biologische Aktivität zeigten. In der vorliegenden Proof-of-Concept Arbeit wurde eine Strategie etabliert, die die Funktionalisierung des Sactipeptids Subtilosin A ermöglichte. Zukünftige Studien werden die Durchführbarkeit dieser Strategie für die Funktionalisierung anderer Sactipeptide untersuchen und prüfen, ob maßgeschneiderte Subtilosin A Varianten mit verbesserten biologischen Eigenschaften entwickelt werden können.

German
Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-218020
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 540 Chemistry
500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
Divisions: 07 Department of Chemistry > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie
07 Department of Chemistry > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Date Deposited: 09 Sep 2022 12:15
Last Modified: 20 Sep 2022 06:23
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/21802
PPN: 499510135
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